DNA測序的原理是末端終止法。具體步驟如下： 1． 定量：對樣品及引物進行定量。 2． 測序反應：在反應體系中加入已定量的模板和引物，BigDye等試劑，PCR儀上完成測序反應。 3． 讀取數據：根據熒光的不同，讀取被測樣品的堿基序列。 ABI公司目前測序結果在800bp以內準確率為98.5%。                                    

 如果您提供的樣品是PCR產物，在測序報告上找不到您的引物是正常的。這是因為測序反應是通過對被熒光標記的ddNTP的讀取而獲得基因序列的，而測序引物由于沒有熒光標記，因此自然在測序結果中就不會被識別。有兩種方法可以得到您的引物序列。對于較短的PCR產物（<800bp），可以用另一端的引物進行測序，從另一端測序可以一直測到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互補序列。對于較長的序列，一個測序反應測不到頭，因此就只能將您的PCR產物片段克隆到適當的載體中，用載體上的通用引物進行測序。由于載體上的通用引物與您的插入序列之間還有一段距離，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測序的起始端總會有一些堿基無法準確讀出，因此，您如果想得到您的PCR產物的完整序列，克隆后進行測序。 如果您提供的樣品是質粒或菌液，PCR產物用T載體克隆后，由于克隆的方向是隨機的，因此，當您在一條鏈上找不到您的引物序列時，試圖在互補鏈上尋找您的引物序列。 當測序引物離您的插入片段很近時，有時可能也無法找到您的引物的全序列。這主要是因為有時測序的起始端由于未去除的染料或引物二聚體的干擾，造成起始區的序列不好，可能無法找到您的引物完整序列。 有時，質粒做模板進行測序時，由于某些原因，質粒上沒有插入外源片段，為空載體，所測的序列為載體序列，此時自然也找不到引物序列。                                    

首先過短的PCR產物純化困難，一般的PCR產物純化試劑盒都要求PCR產物片段大于200bp，過短的PCR產物純化和準確定量都非常困難。因此我們要求用于測序的PCR產物一般不低于200bp長度。 其次，由于測序本身的限制，以一個100bp的PCR產物用于測序為例，去掉兩個引物的序列大約40到50bp，再加上測序起始端的一些讀不出的堿基，真正能夠得到的有用序列不過30～40堿基。上面是在理想的條件下的假設，稍不順利，測序就失敗了。因此，過短的PCR產物，只能克隆后進行測序。                                    

用于測序的引物比用作PCR反應的引物要求高，以下是不適合用于測序反應的引物類型： 1. 不純的引物：用于測序的引物純度要求很高，合成中的小片段會直接造成嚴重的背景峰，因此用于測序的引物序列長度一般在24個堿基之內。 2. 簡并引物，隨機引物和有特殊標記的引物。                                    

非常抱歉，目前我公司不會單獨對客戶的測序反應設定特定的條件，測序反應均在統一的條件下完成。                                    

PCR產物電泳檢測的結果只是一個粗略的定性結果。對于與目的片段條帶大小只相差幾個堿基的非特異性PCR擴增產物是無法用肉眼區分開的。但是DNA測序反應敏感而客觀，可以直接反應出模板本身的情況。需要強調的是，高質量的PCR產物才可能得到高質量的測序結果，如果您對PCR產物的純度不很確定，希望您可以將PCR產物進行克隆處理，得到好的測序結果。以下圖為例：該反應的背景信號較高，不利于堿基的判讀。

解決辦法：改變PCR條件，重新擴增?；蛘呖梢詫⒃揚CR產物克隆到質粒中，初步篩選后進行單克隆測序。

以下圖為例：

堿基缺失常見在PCR產物中，特別是從基因組中擴增得到的PCR片段，上圖的186位缺失兩個連續的T。

解決方法：1) 使用反向引物繼續測序，以矯正缺失位點并達到測通的目的?；蛘邔⒃揚CR產物克隆到質粒中，挑取單克隆測序。

2) 如果可以確定該PCR片段中不應該有缺失的位點，那么可以改變PCR反應條件，重新擴增。

以下圖為例：

引物不純造成移碼現象，該種現象與模板雜在峰圖都表現為背景峰較雜，但是引物不純在峰圖上表現的更有規律，一般在每一個主峰前都有一個同一堿基的小峰。

解決方法：重新合成引物，或者將引物進行PAGE純化后再進行測序。

以下圖為例：

重復結構將導致測序復制框的滑移，重復結構之后峰型混亂。

解決辦法：使用反向引物對模板進行測序，測到該重復結構處，即可完成模板全長的拼接。

以下圖為例：

上圖是pGEM-T載體測序的結果，在83位點處測序結果出現雙峰，即測序結果在載體部分很準確，而進入插入片段后出現雙峰的情況。這是由于在接種時沒有挑單菌落導致的，當兩個以上的正常的克隆（插入片段方向相反），或正?？寺∨c空載體混在一起，而通過酶切和PCR鑒定很難看出異常，尤其在T-A克隆時經常碰到。

解決辦法：重新涂平板挑單菌落測序。需要注意的是，重新進行PCR反應或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。

對于PCR產物也同樣有模板不單一的情況，如下圖所示，

在197bp前測序峰表現為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個高高的A峰，峰標志著此PCR產物中有一個片段大小為200bp左右的小片段。

解決方法：對PCR產物切膠純化，再進行測序。

以下圖為例：

以polyT為例，在polyA/T結構之后往往出現移碼現象，而在polyG/C之后會往往導致測序信號的衰減。

解決辦法：使用反向引物對模板進行測序，測到該poly結構處，即可完成模板全長的拼接。

以下圖為例：

位點94至137是一個回文結構，該結構導致后面的信號衰減，出現錯誤的判讀。

解決方法：使用反向引物對模板進行測序，測到該回文結構處，即可完成模板全長的拼接。

鹽分高是指客戶提供的PCR產物中的鹽離子濃度高。造成樣品鹽離子高的原因是由于客戶在進行PCR反應時，在反應體系中加入的鹽離子濃度過高。鹽離子的來源有PCR反應體系中的緩沖液即buffer，有些情況下是由單獨加入的鎂離子造成的。對于這種樣品，通過電泳檢測是不能對其進行區分的，只有在測序結果出來后分析峰圖才可能發現問題所在，典型的峰圖表現為前70-80甚至100個堿基的峰型基線漂離，嚴重影響測序結果前面部分的準確性。由于通過純化的方法只能部分的去除少量鹽分，無法解決鹽離子對測序結果的影響。