1. 如何測定引物的OD值？
用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時溶液的吸光度稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標準比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進而可以計算出母液的OD值。 舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml并在1ml標準比色杯中測定的吸光度為0.25，說明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。
3. 合成引物的稀釋與保存?
初始拿到的DNA，其性狀為薄膜狀或者粉末狀的白色粉末，附在離心管內(nèi)壁上。稀釋前，請將引物管離心數(shù)秒使DNA聚集到管低，小心開啟管蓋，以免引起粉末飛揚造成DNA損失，再加入適量的TE緩沖液，蓋好管蓋，漩渦振蕩混勻并使其充分溶解。建議將引物稀釋于TE（10mM Tris-HCL，pH8.0，1mM EDTA）溶液中，濃度高于10μM，并于-200C儲存。 例如：如果您需要稀釋到10μM，只需要加入（管內(nèi)總nmol數(shù)/10）ml的TE即可。沒有溶解的引物非常穩(wěn)定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液，分裝數(shù)份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復多次凍融會降低使用壽命）。
4. 熒光標記的DNA如何稀釋與保存？
熒光標記（如HEX,TET,FAM,Cy3，Cy5等）的DNA對光較敏感，在合成及運輸過程中。接到合成引物后，請立即避光保存。對于非Cy類的熒光標記引物，建議將引物稀釋于TE溶液中，濃度高于10μM，并于-20℃儲存于暗盒中。Cy3及Cy5標記的引物在堿性條件下易降解，所以此類引物應于中性條件下在-20℃避光保存。
9. 已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？
如果您溶解引物的水PH過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反復凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR使用材料是模板的質(zhì)量與先前使用的不完全一致。
10. 引物純化方式有哪些，如何選擇？
◆ C18柱脫鹽：有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能去除鹽分。它不能去除比目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應產(chǎn)生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。 ◆ PAGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化。 ◆ HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。
13.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？
連接反應需要引物的5’磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，SiRNA分子具有特殊的對稱結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。
