全長轉(zhuǎn)錄組為什么推薦“三+二”？
目前已報(bào)道全長轉(zhuǎn)錄組文章大都采用“三+二”的模式，三代建庫測序以檢測更準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)變異為主，對于有參考基因組物種可以準(zhǔn)確檢測可變剪切，融合基因，新基因的預(yù)測，對于無參考基因組物種提供準(zhǔn)確的參考序列，有助于后期差異分析；二代測序轉(zhuǎn)錄組研究可以實(shí)現(xiàn)較三代更準(zhǔn)確的定量。此外“三+二”模式可以利用二代的數(shù)據(jù)對三代進(jìn)行校正。
全長轉(zhuǎn)錄組是否需要打斷，拼接？
全長轉(zhuǎn)錄組是基于PacBio Sequel三代測序平臺，無需打斷拼接，直接獲得包含5’，3’UTR，poly A tail的完整轉(zhuǎn)錄本，從而準(zhǔn)確分析有參考基因組物種可變剪切及融合基因等結(jié)構(gòu)信息，克服無參考基因組物種轉(zhuǎn)錄本拼接較短、信息不完整的難題。
如何選擇全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)量？
基于PacBio Sequel平臺，如果是想獲得轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)基因，可選擇1個(gè)文庫測1-3個(gè)Cell （5~15G數(shù)據(jù)），如果想獲得更多低豐度基因，建議1個(gè)文庫測3個(gè)Cell以上。同時(shí)，也需要參考研究物種轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性，如多倍體物種，基因數(shù)量一般相對較多，在參考上述情況后，需適量增加數(shù)據(jù)量。
什么物種適合全長轉(zhuǎn)錄組測序？
有參考基因組和無參考基因組的物種均適合。
全長轉(zhuǎn)錄組測序如何取樣？
主要依據(jù)研究目的而定。通常，如果想獲得某物種比較多的轉(zhuǎn)錄本信息，建議采集不同組織樣本提取RNA，等量混合測序，得到盡可能多的表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。如植物，建議取根、莖、葉、花、果實(shí)等；如動物，建議取肝臟、腎臟、腸、皮膚等部位；如果只針對某個(gè)組織部位進(jìn)行組織特異性全長轉(zhuǎn)錄組分析，則可只對該組織取樣，也可以取該組織不同的發(fā)育時(shí)期樣品提取RNA，等量混合分析。
