2018-08-07
研究背景
雌激素是一種甾體激素，對雌性繁殖有廣泛的影響。在生殖期，雌激素的合成主要在卵巢卵泡的體細胞（卵泡膜細胞，TCs和顆粒細胞，GCs）中。然而在哺乳動物和鳥類中其合成位置并不相同。在哺乳動物中，TCs從頭產生雄激素，GCs進行雌二醇轉化。然而由于未知的原因，在鳥類中TCs產生睪酮和雌二醇（一種雌激素）。
CYP19A1編碼芳香酶，是負責雌激素的生物合成的關鍵步驟。哺乳動物牛中，雌二醇在卵泡選擇后的分化階段達到高峰，而在家禽雞中，CYP19A1 在選擇階段的黃色小卵泡中達到最高水平。目前，禽類的卵泡選擇機制和兩種主要細胞TCs,GCs在卵泡中的功能尚不清楚。而哺乳動物牛的卵巢發育被很好的研究，因此通過比較轉錄組利用基因共表達網絡分析（WGCNA）有利于深入研究雞中卵巢發育機制。
WGCNA基本分析流程：
1. 構建基因共表達網絡：使用加權的表達相關性。
2. 識別基因集：基于加權相關性，進行層級聚類分析，并根據設定標準切分聚類結果，獲得不同的基因模塊，用聚類樹的分枝和不同顏色表示。
3. 如果有表型信息，計算基因模塊與表型的相關性，鑒定性狀相關的模塊。
4. 研究模塊之間的關系，從系統層面查看不同模塊的互作網絡。
5. 從關鍵模型中選擇感興趣的關鍵基因，或根據模塊中已知基因的功能推測未知基因的功能。
研究方法
測序平臺：Illumina sequencing (Sequencing Mode: Paied-end, 2 ? 150 bp)
實驗對象 | 實驗材料 | 組名 | 重復次數 |
雞 | 選擇前期：直徑6～8mm小黃卵泡（樣品1,3,5,7用于顆粒細胞；樣品2,4,6,8用于卵泡膜細胞） | chicken_SYF | 4+4 |
牛 （數據來源網絡） | 分化階段:LH出現前的卵泡期 | cow_D | 17 |
選擇期：黃體期新選擇的優勢卵泡 | cow_S |
研究結果
1、基因共表達網絡構建和模塊劃分
根據基因表達加權相關性進行聚類分析，設置每個模塊中最少包含30個基因， chicken_SYF形成23個模塊，cow_D 形成17 個模塊 ，cow_S形成18 個模塊。圖1為chicken_SYF模塊聚類樹，不同的顏色代表不同的模塊。
圖1 基因共表達網絡的可視化表示
2、chicken_SYF與牛分化期的卵泡網絡模塊高度相似
利用基因重疊分別檢測chicken_SYF與cow_D和cow_S一致的模塊，圖2-A顯示chicken_SYF（紅色線）與cow_D（藍色線）高度保守。 以CYP19A1基因表達為性狀，并將模塊基因與該性狀的關聯通過量化來定義基因顯著性（Gene Signi?cance，GS）。
圖2 物種間模塊相似性和chicken_SYF模塊-性狀相關性
3、確定基因模塊與性狀的關聯性
模塊-性狀關系分析發現，兩個模塊與CYP19A1基因表達顯著相關：具有4588個注釋基因的天藍色模塊（turquoise module）(r=?0.86, P=0.006)和具有1980個注釋基因的淡剛藍模塊（lightsteelblue1 module ）(r=0.96, P=2E-04)。
圖3 chicken_SYF中模塊-性狀相關性
4、關聯模塊中關鍵基因的功能分析
A1為天藍色模塊基因的網絡描述，A2為淡剛藍模塊基因的網絡描述，其中紅色表示關鍵基因。
圖4 雞模塊基因網絡及其功能分析
表1顯示天藍色模塊中大多數基因參與基因的轉錄調控（包括表觀遺傳調控）、細胞黏附以及雄激素和雌激素受體信號通路。淡剛藍模塊中大多數基因參與了基因轉錄調控以及蛋白質的磷酸化和去磷酸化。這些關鍵基因中包含兩個重要的轉錄因子（ESR2, ALX1）。
表1 天藍色模塊和淡剛藍模塊中排名前10的關鍵基因
5、ESR2可能是調控CYP19A1基因的轉錄因子
之前研究表明CYP19A1在牛的GCs中表達，而在雞的TCs中表達。通過計算這兩個物種GCs和TCs中差異表達基因（DEGs），將其與JASPAR網站預測轉錄因子進行比對，最終獲得兩個可能的轉錄因子ESR2和Npase2（表2）。結合WGCNA分析得到的雞的與CYP19A1表達相關的關鍵基因（表1）也包含ESR2，最終認為ESR2是CYP19A1潛在調控因子。
表2 通過JASPAR網站預測轉錄因子
6、RT-PCR檢測 ESR2和CYP19A1表達
雞中CYP19A1在小黃卵泡發育階段（TCs）達到表達高峰，并且在GCs中無表達（圖6-A）。ESR2在TCs中表達顯著高于GCs（圖6-B），實驗初步證明ESR2 與CYP19A1存在相關性。
圖6 雞中卵泡發育階段CYP19A1表達模式和小黃卵泡中關鍵基因表達情況
7、雞中ESR2抑制CYP19A1基因表達
構建CYP19A1啟動子片段與熒光素酶融合表達載體，利用熒光素酶報告基因在293T（圖7-A）和DF-1(圖7-B)細胞中檢測CYP19A1啟動子片段（cp2-cp5）活性，發現其均具有啟動子活性。
圖7 CYP19A1啟動子片段活性
在圖7的基礎上于293T細胞中分別將啟動子片段cp2與熒光素酶共表達載體PGL3-cp2與不同濃度的ESR1表達載體質粒pcDNA-ESR1共轉發現熒光素酶活性顯著下降（圖8-A），不同CYP19A1啟動子片段的表達載體與ESR1表達載體質粒pcDNA-ESR1共轉，發現ESR1可以降低其熒光素酶活性。因此確定ESR1抑制CYP19A1表達。
圖8 ESR2對CYP19A1啟動子片段活性的影響
總結
1 物種間相似生物過程的比較特別是對一個研究較少的物種與一個研究的較好物種進行比較，不僅有助于了解兩個物種之間的進化保守性，而且還能為研究較少物種的特定生物過程的機制提供新的見解。
2 該研究基于WGCNA比較牛和雞的卵泡選擇過程。雞的小黃卵泡和牛卵泡分化階段之間觀察到高度的種間模塊保守性。該結果將有助于利用牛卵泡發育信息了解雞卵泡的發育機制。
3 “卵泡選擇”一詞用于哺乳動物和鳥類，這表明在不同物種中有相似的過程。結果表明，其發生在牛和雞的不同階段。如圖9所示，牛卵泡選擇后的分化階段實際上與雞的小黃卵泡選擇階段相當。
圖9 雞和牛卵泡發育比較示意模型
4 該研究中，在雞卵泡的TCs中確定了ESR2作為CYP19A1潛在的調節因子，因為其與CYP19A1具有類似的表達模式，并且雞中ESR2直接抑制CYP19A1的表達。
文獻索引
Jing R, Gu L, Li J, et al. A transcriptomic comparison of theca and granulosa cells in chicken and cattle follicles reveals ESR2 as a potential regulator of CYP19A1 expression in the theca cells of chicken follicles[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 2018, 27: 40-53.
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1744117X18300170?via%3Dihub=
