2017-08-13
2017年6月，派森諾生物與廣東省微生物研究所合作，在《Frontiers in Immunology》（影響因子6.429）發表論文，報道了一種來自于猴頭菇的真菌蛋白（HEP3）可通過改變免疫抑制小鼠和炎性腸病小鼠的腸道菌群而發揮免疫調節作用。
研究背景
炎性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性腸道炎癥性疾病，其癥狀表現為腹痛、腹瀉、便血和體重減輕等。有證據表明，IBD的發生可增加結直腸癌的患病幾率。隨著生活水平的提高，飲食結構發生變化，高脂肪食物攝入量增多，IBD在我國的發病率呈快速增長的趨勢。
目前對于IBD的治療，尚無特異性強而毒副作用小的藥物。針對IBD開發具有確切治療效果且毒副作用低的新型藥物，具有重要的科學意義和臨床價值。
猴頭菇是藥食兩用真菌，其活性成分具有保護神經、降血糖、抗癌、抗氧化、抗衰老等功效，所產生的真菌蛋白具有免疫調節作用，因而為IBD新藥的開發提供了可能。
研究目的
對猴頭菇中的真菌免疫調節蛋白（HEP3）進行提取純化，并將其應用于炎性腸病小鼠的治療。通過比較不同處理間小鼠腸道的菌群差異，探索猴頭菇蛋白對免疫抑制小鼠和炎性腸病小鼠的腸道菌群的影響，及其通過改變腸道菌群而產生的免疫調節作用。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA V3-V4區測序
實驗設計：
1、 將小鼠隨機分成4組，分別做如下處理：
實驗對象 | 處理方式 | 組名 | 樣品數 |
昆明雄性小鼠 | 無任何處理 | Z | 10 |
環磷酰胺處理 | M | 10 | |
環磷酰胺和100mg/kg HEP3處理 | D | 10 | |
環磷酰胺和200mg/kg HEP3處理 | G | 10 |
2、將小鼠隨機分成9組，分別做如下處理：
實驗對象 | 處理方式 | 組名 | 樣品數 |
昆明雄性小鼠 | 無任何處理 | Normal | 9 |
TNBS處理 | TNBS | 9 | |
TNBS和HEP3處理 | HEP3 | 9 | |
TNBS和Bifdobacterium處理 | 9 | ||
TNBS和抗生素處理 | TNBS +Antibiotics | 9 | |
TNBS、抗生素和HEP3處理 | HEP3+Antibiotics | 9 | |
TNBS、抗生素和Bifdobacterium處理 | Bifdo+ Antibiotics | 9 | |
TNBS、HEP3和Bifdobacterium處理 | Bifdo+ HEP3 | 9 | |
TNBS、HEP3、抗生素和Bifdobacterium處理 | Bifdo+ Antibiotics+HEP3 | 9 |
研究結果
1. 猴頭菇蛋白HEP3對IBD大鼠的抗炎作用
HE染色和免疫組化實驗結果顯示，HEP3對IBD大鼠具有顯著的抗炎作用。
2. HEP3是一種免疫調節蛋白
HEP3可通過上調或下調TNF-α、1L-1β、1L-6等細胞因子及iNOS的產量，對脂多糖活化的小鼠RAW 264.7巨噬細胞進行免疫調節，實現了HEP3的免疫調節作用。此外，HEP3還能夠顯著降低D-半乳糖誘導的HIEpiC衰老細胞的氧化應激反應，促進衰老細胞的增殖。
3. HEP3可改善小鼠體內由環磷酰胺誘導的免疫毒性
HEP3可通過活化T細胞，降低小鼠體內高劑量環磷酰胺誘導的免疫毒性。
4. 環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的腸道菌群組成
取環磷酰胺誘導實驗的4組小鼠（Z、M、D、G）的盲腸內容物進行高通量測序，對測序數據進行分析。對照組（Z）和環磷酰胺誘導組（M）兩組間的Venn圖、PCA主成分分析及熱圖分析結果顯示，Z和M的微生物組成具有顯著差異。與Z組相比，在屬水平上，M組Oscillospira、Prevotella、Helicobacter和Bilophila的豐度有所下降，而Jeotgalicoccus、Staphylococcus、Acinetobacter、Aerococcus、Lactobacillus、Corynebacterium、Rikenell、Enterobacter、Proteus、Anaerotruncus和Trabulsiella的豐度有所增加。
四組間比較結果表明，經過HEP3處理的M組和D組具有更高的微生物物種豐富度，且4組間的群落組成具有顯著差異。與M組比較發現，在門水平，HEP3處理組Actinobacteria、Bacteroidetes和Proteobacteria的物種豐度具有顯著變化，但與Z組較為接近。Venn圖結果顯示，HEP3會改變腸道菌群組成。
在屬水平，HEP3處理組的Corynebacterium、Bacteroides、Enterobacter、Acinetobacter、Desulfovibrio和Lactobacillus相對豐度增加了，但病原菌的相對豐度減少了。菌群代謝功能預測分析結果顯示，環磷酰胺處理組（M）的生物代謝較為緩慢，然而經過HEP3處理后，幾乎所有代謝恢復甚至高于正常水平。
5. HEP3通過腸道菌群增強免疫活性
實驗結果表明，對于炎性腸病患者，抗生素的使用會加重結腸組織的損壞；而HEP3和Bifdobacterium均具有抗炎作用，可緩解病癥，且兩者之間具有協同作用。
6. HEP3顯著提高了Bifdobacterium的植入活性
對Normal、TNBS、HEP3、Bifdo、TNBS +Antibiotics、HEP3+Antibiotics、Bifdo+ Antibiotics、Bifdo+ HEP3、Bifdo+ Antibiotics+ HEP3這9組小鼠的盲腸內容物進行取樣測序，數據分析結果顯示，在HEP3組，Bifdobacterium及其它益生菌的相對豐度是增加的，HEP3顯著提高了Bifdobacterium的植入活性。
物種互作關聯網絡分析結果顯示，在IBD小鼠腸道中，抗生素破壞了整個腸道微生態系統的菌群多樣性和穩定性，而HEP3則維持了其多樣性與穩定性。
7. HEP3能夠抑制腫瘤生長
腫瘤抑制實驗結果表明，在人類前列腺癌細胞移植模型小鼠中，HEP3可以抑制癌細胞CC531的生長。低劑量HEP3處理組（HL）和高劑量HEP3處理組（HH）對腫瘤細胞的抑制率分別為35.73%和70.61%。在HL組和HH組中，免疫和炎癥相關的β2-GM、TNF-α、IFN-γ、M-CSF、TGF、VEGF等細胞因子均接近正常水平。由此可知，HEP3是一種對腫瘤具有強效抑制作用的真菌免疫調節蛋白，未來有望應用于腫瘤治療。
總結
本研究的亮點在于，不僅通過前期免疫組化實驗證實了猴頭菇蛋白HEP3對炎性腸病的抗炎效果，又經過后續多次的動物實驗，結合高通量測序分析，揭示了HEP3對炎性腸病的抗炎作用是通過改變小鼠腸道菌群、進而產生免疫調節實現的，兩相結合，深入地闡明了HEP3的免疫調節作用及其作用機制。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：
Chen D, Zheng C, Yang J, et al. Immunomodulatory activity of a fungal protein extracted from Hericium erinaceus through regulating the gut microbiota[J]. Frontiers in Immunology, 2017, 8: 666.
原文鏈接：http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2017.00666/full
