2018-06-06
發表期刊：The Royal Society of Chemistry, RSC Advances
影響因子：3.108
派森諾生物與中國農業科學院油料作物研究所攜手合作，于2018年3月20日在RSC Advances上發表了關于GA對HCT116人結腸癌細胞表達影響的轉錄組分析的研究成果《Transcriptome analysis reveals GA induced apoptosis in HCT116 human colon cancer cells through calcium and p53 signal pathways》。
研究背景：
羥基肉桂酸和羥基苯甲酸是許多食用植物中常見的食用酚酸和微量營養素，在人體內具有顯著的生物活性。沒食子酸（GA）是一種典型的羥基苯甲酸，在許多水果和蔬菜中廣泛分布，具有顯著的抗氧化，抗炎，抗菌，抗病毒等生物活性。先前的報道顯示GA可以誘導結腸癌中的細胞死亡，但關于其凋亡效應的誘導機制尚未完全闡明。
研究方法：
樣本：三組人結腸癌HCT116細胞樣本（對照組 + GA處理 12 h + GA處理24 h）每組三個重復
平臺：Illumina HiSeq
研究結果：
1. GA對細胞增殖的影響
通過CCK8試驗，評估了GA對結腸癌細胞增殖和生長的影響。如圖1a所示，24 h的GA處理以劑量依賴性的方式顯著降低了HCT116和SW48細胞的存活能力，且HCT116細胞對GA的敏感性高于SW48和RKO細胞。另外還發現，GA對HCT116細胞有一種依賴時間的抑制作用（圖1b）。在使用50 mM GA處理后，HCT116細胞的存活能力急劇下降（12 h到60.5%，，24小時內達到34.8%）。然而，在較低的GA濃度下，12 h和24 h細胞存活能力幾乎沒有任何區別。
2. GA對HCT116細胞凋亡的影響
使用膜聯蛋白V-PI雙重染色和流動儀結果來評估細胞凋亡（Fig. 2）。與對照組相比，25 mM 、50 mM 、100 mM GA處理24h后的凋亡細胞的百分比(右上)顯著增加。結果表明，通過誘導細胞凋亡，GA可以部分抑制HCT116細胞的增殖。
3. GA對基因表達模式的影響
在不同的時間點上對總體轉錄組的差異進行分析，熱圖見圖3a。在每個序列樣本中，有超過67%的基因表達（RPKM > 1）。主成分分析（圖3b）表明，在一個組中，相似的樣本聚集在一起，這與熱圖結果一致。GA處理12 h與未處理和24 h處理的細胞形成了一個截然不同的集群。
12 h GA處理后61個基因（7.7%）的表達增加，730（92.3%）個基因表達減少（圖4a）。相比之下，在處理12 h 到24 h過程中，有超過93.2%的差異表達基因（849個基因）上調，只有6.8%（62個基因）的基因下調。每個成對比較組之間的共有特有DEGs在維恩圖中顯示(Fig. 4b)。轉錄組分析顯示，在前12h和后12h的處理過程中，共享648個差異基因，他們的調節模式存在差異。GA12-C組中611個下調的基因在GA24- GA12組中是上調的。GA12-C組中37個上調的基因在GA24- GA12組中下調。在GA24-C組和GA24-GA12組中檢測到14個DEGs。
4. DEGs 的GO和 KEGG富集分析
圖5a中展示了前30個富集的GO terms。C-GA12組的791個DEGs中738個基因顯著富集在鈣離子結合、血漿膜、胞外區和單多細胞生物過程的GO terms上。隨著處理時間延長，DEGs的數量增加。在GA12和GA24之間，大約92.8%（845個）的DEGs被歸類到4577個 GO terms，顯著富集在鈣離子結合及相關渠道、血漿膜、胞外區域和細胞外圍等功能上。當C組與GA24組的細胞進行比較時，只富集到FMN結合功能上。
圖5b顯示了在前12 h和后12 h處理中，DEGs的前20個顯著富集的KEGG通路。大部分都涉及到新陳代謝和信號轉導。富集的路徑主要與組織系統和環境信息處理有關。此外，還有與脂質代謝和環境適應有關的精氨酸和脯氨酸代謝以及晝夜節律的通路。長時間的GA處理組得到的差異基因主要富集在鈣信號通路、花生酸代謝、細胞粘附分子和ErbB信號通路，同時還觀察到與細胞群落和細胞生長和死亡相關的兩種通路，焦點粘連和p53信號通路。
5. 與增殖和細胞凋亡相關的代謝途徑
來自前10個顯著富集途徑的基因可以被認為是GA處理的重要調控因子（特別是C-GA12組和GA12-GA24組之間共有的差異基因），具體結果見Table 1。大部分基因表達模式顯示，在24 h的處理期間是開始下調，然后上調。但是基因Per2 ，NRG1以及THBS1在C-GA12組中上調，在GA12-GA24組中下調。
基于GO和KEGG富集分析，對由GA處理引起的HCT116細胞的變化進行概述。如圖6所示，GA通過下調鈣通道阻斷早期治療中的細胞生長，然后通過激活凋亡半胱天冬酶上調內源性p53信號途徑來觸發HCT116細胞的細胞凋亡，最終引發線粒體凋亡途徑。這表明，為了對GA處理作出反應，HCT116細胞可能會重新規劃基因表達，以優化信號轉導，從而實現更有效的適應。
6. RT-qPCR驗證RNA-seq結果
我們隨機選擇了12個不同代謝途徑的DEGs來驗證它們的表達水平，結果見Table 2。RT-qPCR結果顯示驗證結果與RNA-seq結果一致，表明RNA-seq的結果相當可信。
原文索引：
Yang C, Xie X, Tang H, et al. Transcriptome analysis reveals GA induced apoptosis in HCT116 human colon cancer cells through calcium and p53 signal pathways[J]. Rsc Advances, 2018, 8(22):12449-12458.
