2017-10-25
絞股藍是多年生匍匐草本植物，在亞洲廣泛種植，有很多重要的藥用屬性。絞股藍皂苷，是絞股藍中的主要有效成分，已被充分研究。考慮到絞股藍重要的藥用功能，做絞股藍的轉錄組信息研究是很有必要的，有利于開展以后的轉錄調控研究。廣西醫科大學吳耀生教授團隊和上海派森諾合作，通過絞股藍測序，總共獲得了50,654,708個unigenes。通過計算unigene的表達量，并將數據和五個常用數據庫進行比對，獲得unigenes不同方面的注釋信息。發現DESeq分析結果中FPS，SS和SE酶表現出不同的表達水平。相對于根和莖，葉片中FPS，SS和SE的表達量是高的。本研究通過對自然環境生長的絞股藍進行轉錄學分析，發現unigene的表達，酶的表達（FPS,SS和SE）和絞股藍皂苷的分布是一致的。
絞股藍的主要有效組成是絞股藍皂苷，它有多種多樣的生物活性，這可以解釋絞股藍為什么會在天然藥學中有廣泛應用。例如，絞股藍皂苷可以通過增加胰島素降低血糖。還有其他功能應用像抗癌，抗炎癥，抗焦慮，降血脂，保護肝細胞，神經保護和免疫保護等等。三帖合成途徑可以分解為三個部分：1、IPP(異戊烯基焦磷酸)或者DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸酯）合成；2、鯊烯合成和環化；3、功能化反應獲得鯊烯復合物（圖1）。和人參皂苷一樣，絞股藍皂苷在藥學和健康學中有很多重要應用。但是絞股藍皂苷和人參皂苷相比，有更高的異質性，其中有超過169種絞股藍皂苷。絞股藍比人參中的三萜化合物種類高出5倍。這可能和三帖合成途徑中的基因與酶的差異表達相關。
圖1 三帖合成途徑
高通量測序獲得352,999,296條原始reads，過濾掉接頭和低質量序列，剩余249,488,643條clean reads。組裝之后得到1,119,964個contigs，總長度達249,488,543bp。將contigs拼接成轉錄本，得到159,858,904個轉錄本序列。和NR數據庫比對后，獲得50,654,708個unigene，平均長度755bp。
用NR，GO，KEGG，eggNOG和Swiss-Port數據庫注釋unigenes。整體看來，eggNOG中鑒定率高，達到96.57%，KEGG中鑒定率低，只有8.77%。
表1 unigenes 注釋結果
統計unigene的RPKM，做RPKM的密度分布圖。發現中等范圍表達量的unigenes的AUC（曲線下面積）占絕大部分，低表達或者高表達的unigenes的AUC是少部分的（圖2）。通過密度分布圖發現，纖維根中的unigenes要比莖和葉片中的unigenes表達量高。盡管莖和葉片有相似的unigene表達量，莖中的表達量稍微高于葉片中的表達量。另外分析編碼FPS,SS,SE和β-AS（β-香樹精合成酶）的unigenes的表達，發現這些unigenes在葉片中高表達，在纖維根中低表達，在莖中要比纖維根中表達量高。編碼β-AS的unigene在葉片中的表達量是纖維根中的將近125倍。通過DESeq軟件做兩兩比較分析測序數據，通過韋恩圖展現出差異表達的unigene的分布情況（圖3）。
表2 樣品中unigenes的RPKM值
表3unigenes兩兩比較上下調基因統計結果
圖2 unigenes的RPKM密度分布圖
圖3差異unigenes的韋恩圖
分光光度法測定絞股藍的皂苷含量分布。所有的樣品中葉片的皂苷含量高（3.189%），在莖（0.365%）或者纖維根（0.172%）中皂苷含量比較低。
表4 絞股藍中皂苷含量分布
基于KEGG通路分析，將涉及三鐵合成通路有關的酶分為三類：1、IPP或者DMAPP合成相關的酶；2、鯊烯合成和環化相關的酶；3、鯊烯功能化反應中的酶。文中主要關注的是FPS,SS和SE三種酶，它們在三帖合成和環化中起重要作用。首先FPS比較分析結果中，只有纖維根和葉片中的表達比較有差異。再次，SS比較分析結果中，兩組分析結果中有差異，表明葉片中的表達要高于纖維根和莖。最后，在SE比較分析結果中，葉片中的表達高于莖和纖維根，而 且纖維根中的表達高于莖（圖4）。
圖4 FPS，SS，SE中基因的RPKM
在unigene功能注釋，RPKM表達量統計和絞股藍含量測定之后，分析unigene表達，酶（unigene的產出物）的表達和絞股藍皂苷的含量分布之間的關聯，發現unigene和酶的表達與皂苷含量分布呈正相關。也就是說樣本（纖維根，莖，葉片）中unigene和酶（FPS，SS和SE）的表達取決于皂苷含量的分布。這一結論，有利于絞股藍中其他次級代謝產物的深入研究。
文獻來源
Chen Q, Ma C, Qian J, et al. Transcriptome Sequencing of Gynostemma pentaphyllum to Identify Genes and Enzymes Involved in Triterpenoid Biosynthesis[J]. International journal of genomics, 2016.
