2024-11-14
文章題目：Foliar application of exogenous salicylic acid mitigates the detrimental effects caused by salt stress in sunflower seedlings
技術手段：轉錄組、RT-qPCR
長治學院于近期在農林科學1區TOP期刊《Industrial Crops and Products》上發表了聚葉面噴施外源水楊酸減輕鹽脅迫對向日葵幼苗的不利影響的研究成果。
本研究的轉錄組測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
隨著工業現代化和灌溉土地及設施的擴大，土壤鹽堿化問題日益嚴重，極大地阻礙了植物的生長和生產，影響了全球農業的可持續發展。土壤中的高濃度鹽分還會導致滲透勢的變化，嚴重限制土壤成分的吸收和利用，引起滲透脅迫、養分脅迫、離子脅迫和活性氧積累等脅迫反應。由于細胞內抗氧化酶系統不穩定，持續的鹽脅迫會導致活性氧（ROS）積累。植物體內鈉和氯離子的過度積累會導致嚴重的離子中毒，極大地影響氮和鎂的吸收，尤其在葉片中會直接抑制光合作用。控制植物對鹽脅迫反應的要素之一是激素，如水楊酸（SA）。SA能通過激活抗氧化系統和合成與增加滲透壓有關的物質，促進鹽脅迫下植物的光合作用，從而降低鹽脅迫對植物的負面影響，增強植物在鹽脅迫下的防御反應。
向日葵具有很強的抗非生物脅迫能力，可在多種土壤中栽培，由于其生長周期短，適應環境的能力強，可以作為研究抗性機制的理想模型。為了評估外施SA對遭受鹽脅迫向日葵幼苗的影響，本研究通過葉面噴灑四種不同濃度的SA對向日葵幼苗進行了處理，隨后進行了生理學和轉錄組學研究，以確定提高向日葵植物耐鹽性的最有效濃度，并深入了解其潛在機制。
技術路線
研究結果
不同濃度的SA對鹽脅迫下向日葵植物光合作用參數的影響
在鹽脅迫條件下，植株高度和莖直徑明顯下降；但與 NaCl 條件下相比，葉面噴施SA（尤其是SA2和SA3）能有效提高這些生長指標。對幼苗光合參數的比較表明，在鹽脅迫下，Fv/Fo比值降低了18.0%，Fv/Fm比值降低了4.0%，PIabs降低了52.5%。外源施用SA1、SA2、SA3和SA4后，與單獨施用NaCl相比，Fv/Fo、Fv/Fm、PIabs值都有增加。此外，當植物受到鹽脅迫時，PSII反應中心（即ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC和ETo/RC）的能量流參數也發生了一定程度的變化。總之，鹽脅迫會在一定程度上抑制向日葵幼苗的光合作用，但外源SA可以緩解這種抑制作用。
圖1 6個處理下向日葵幼苗表型及光合參數比較
鹽脅迫下SA對向日葵ROS和抗氧化系統的影響
當遭受鹽脅迫條件時，向日葵植物的MDA、O2.-、-OH和H2O2含量分別顯著增加190.8％、52.4％、301.8％和357％。相反，與NaCl存在下觀察到的結果相比，不同濃度的外源SA的存在導致ROS和MDA水平降低。表明SA的應用抑制了產生超氧自由基和羥基自由基，減輕對植物細胞的傷害，減輕氧化損傷。此外，SA2對MDA和O2.-的產生具有最大的抑制作用，SA4對-OH和H2O2的產生具有最大的抑制作用。NaCl處理增加了向日葵中抗氧化酶（SOD、POD和APX）的活性，但抑制了CAT活性。與其他處理相比，SA2誘導APX和SOD活性的增加。非酶抗氧化劑中，ASA-GSH系統中的AsA、GSH和DHA可以去除H2O2，維持AsA和GSH之間的平衡。鹽脅迫下AsA、DHA和總AsA含量以及AsA/DHA比值增加。AsA和總AsA含量顯著增加，分別增加了58.8%和20.6%，而DHA含量和AsA/DHA比值沒有顯著影響。外源SA處理后，隨著SA濃度的增加，AsA和總AsA含量先升高后降低，其中AsA含量在SA2時達到峰值。綜上，鹽脅迫可以導致抗壞血酸的產生來保護細胞，而低濃度的SA可以進一步誘導幼苗產生更多的抗壞血酸，從而增強向日葵植株清除過量ROS的能力。
圖2 鹽脅迫下ROS含量、抗氧化酶活性和非酶抗氧化水平比較
SA2和SA3的表達譜比其他處理更接近CK的表達譜
為了進一步研究SA減輕向日葵鹽脅迫的潛在分子機制，我們對18個文庫進行了RNA-seq（CK、NaCl、SA1、SA2、SA3、SA4），總共82782萬個原始讀數，經過質控得到了76037萬條高質量讀數。其中，大多數表達的基因（FPKM>1）表現出中等表達水平（1100）。對18個文庫進行了層次聚類相關分析和PCA，以揭示生物重復和樣本間表達譜的相似性。CK、NaCl和SA（SA1-4）樣品明顯分離，表明在鹽脅迫下以及使用SA緩解鹽脅迫時，表達譜發生了變化。SA1、SA2和SA3樣品與CK接近，SA4和NaCl樣品與CK相差較遠，說明SA1、SA2和SA3對鹽脅迫有一定緩解作用，且SA2和SA3的程度大致相同的效果。綜上所述，SA尤其是SA2和SA3處理可以有效緩解鹽脅迫。
圖3 18個文庫的轉錄組圖譜
不同濃度SA對鹽脅迫下向日葵基因表達的影響
本研究重點關注五個比較組，并確定了總共11,312個DEG（P.adj<0.05，|log2FC|>1.0）。在這五個比較中確定了302個共享DEG，并且在除NaCl與CK外的四個比較中共享了382個DEG。根據302個共享DEG表達譜的層次聚類，DEG分為兩個分支，一個由SA4和NaCl組成，另一個由CK、SA1、SA2和SA3組成。聚類模式表明SA1、SA2和SA3在一定程度上表現出緩解鹽脅迫的良好潛力，接近CK組的緩解水平。相反，觀察到SA4在緩解鹽脅迫方面無效。本研究還檢查了轉錄因子（TF）的表達模式，這些轉錄因子受到差異性調節，并在減輕外源SA對遭受鹽脅迫的向日葵幼苗的影響方面發揮作用。差異表達轉錄因子數量最多的家族是ERF（乙烯反應因子）、bHLH（堿性螺旋-環-螺旋）、NAC、MYB、WRKY、C2H2、HD-ZIP（同源域-亮氨酸拉鏈）、MYB-相關的bZIP（堿性亮氨酸拉鏈）和COL（CO樣）家族。總共鑒定出45個TF家族和727個TF成員，其中23個TF成員和32個TF家族在比較組之間共享。由此可見，許多TF家族參與了外源SA對鹽脅迫的響應。最后，本研究隨機選擇10個基因，通過RT-qPCR進行表達定量，以驗證RNA-seq結果的準確性。
圖4 DEG的比較和表達譜
DEG分析
與NaCl相比，在四種SA處理中，DEG在192、384、450和210個GO條目中顯著富集，其中33個在比較中共享。有15個共享顯著富集的BP，如細胞激素代謝過程、氣孔運動和氧化還原輔酶代謝過程。在各個比較組中顯著富集的其他BP包括對鈣離子的反應、氣孔復合體發育、氣孔運動、SA代謝過程的調節、ROS生物合成過程、SA生物合成過程對SA的反應以及萜類生物合成過程。根據KEGG富集分析，15、10、16、12和13個KEGG通路分別在NaCl vs CK、SA1 vs NaCl、SA2 vs NaCl、SA3 vs NaCl和SA4 vs NaCl中顯著富集，僅共享一個KEGG通路，即光合作用天線蛋白。SA1 vs NaCl和SA2 vs NaCl均表現出9個顯著富集途徑的共性，包括光合生物中的光合作用、碳代謝和碳固定。SA2 vs NaCl以及SA3 vs NaCl在10種常見通路中表現出顯著富集，包括輔因子生物合成、卟啉代謝和核糖體。此外，SA3 vs NaCl和SA4 vs NaCl的比較揭示了四種常見途徑的顯著富集，包括次生代謝物的生物合成和MAPK信號途徑植物。總之，植物鹽脅迫的緩解可能涉及光合作用、植物激素信號轉導、MAPK信號通路以及響應SA的次級代謝產物生物合成等過程。
圖5 五個比較中DEG的GO和KEGG富集分析
DEG的K-means分析
為確定與向日葵響應鹽脅迫和SA脅迫緩解作用相關的DEG的主要表達趨勢，采用K-means聚類將11,312個DEG分為15個表達簇（C1-C15）。來自C2（1059，25個TF）、C3（975，90個TF）、C6（676，60個TF）、C9（534，58個TF）和C13（674，50個TF）的基因表達趨向于氯化鈉處理后減少，并隨著外源SA的應用而增加。來自C6、C9和C13的基因表達在SA2中達到峰值，來自其余兩個簇（C2和C3）的基因表達在SA3中達到峰值，所有基因的表達在SA4中最低。此外，C5（1087，56個TF）和C10（1417，66個TF）的DEG在NaCl處理后表現出表達上調。隨著外源SA濃度的增加，DEG的數量逐漸減少，在SA2或SA3達到峰值，之后DEG的數量增加。此外，C12中基因的表達在NaCl脅迫下保持不變。然而，隨著SA濃度的增加，表達水平增加，在SA3中達到峰值，但在SA4中急劇下降。為了探索這些差異表達基因在減輕鹽脅迫有害影響方面的可能作用，我們對這八個基因簇進行了GO和KEGG富集分析。鹽脅迫下表達下調的基因主要參與光合作用、次生代謝產物的產生、碳同化和植物激素信號傳遞等過程。與核糖體、ATP 代謝、SA代謝、氧化磷酸化和蛋白酶體相關的通路基因因鹽脅迫而下調。
圖6 對五個比較組中確定的DEG進行K-means聚類分析
使用WGCNA進行基因共表達網絡分析
本研究還進行了WGCNA，以確定共表達的基因簇和核心調控基因，這些基因在SA減輕鹽脅迫影響的能力中發揮作用。11,312個DEG被分為11個共表達模塊。我們選擇了4個與向日葵對鹽脅迫和SA的反應相關的模塊，解釋了模塊和樣本之間的關系。此外，在黃色模塊中識別出93個TF，在藍色模塊中識別出112個TF，在綠色模塊中識別出49個TF，在棕色模塊中識別出195個TF。這449個TF屬于42個家族，其中bHLH、ERF和MYB家族數量最多；這些家族與植物對非生物脅迫的反應密切相關。對這四個模塊中的基因進行了功能富集分析，旨在更深入地了解SA處理減輕向日葵鹽脅迫引起的損傷的潛在分子機制。黃色模塊在真核生物的核糖體生物發生、核糖體和蛋白酶體途徑中表現出顯著的富集。藍色模塊富集于多種途徑，包括磷酸戊糖途徑、光合作用、淀粉和蔗糖代謝、光合生物中的碳固定、代謝途徑、次生代謝物的生物合成和碳代謝。綠色模塊主要富集光合作用、光合作用-天線蛋白、不飽和脂肪酸生物合成和代謝途徑等過程。棕色模塊主要富集于抗壞血酸和醛糖代謝以及植物激素信號轉導。篩選了藍色模塊中主要與碳固定相關的基因、棕色模塊中與激素信號轉導相關的基因、綠色模塊中與光合作用相關的基因、黃色模塊中與核糖體相關的基因以及各自模塊中的TF來構建共表達網絡并識別中心調控基因和轉錄因子。
圖7 鑒定出的DEG的共表達網絡分析
結 論
葉面噴施一定濃度的外源SA溶液可顯著減輕鹽脅迫對向日葵幼苗的不利影響。SA可以部分促進鹽脅迫下向日葵幼苗的生長和光合作用，導致SA處理后ROS和MDA水平降低。SA增強抗氧化酶活性和AsA-GSH含量，有效減輕ROS積累和膜氧化損傷。DEG在與光合作用-天線蛋白、光合作用、氨基酸代謝和核糖體相關的通路中顯著富集。通過K-means聚類和WGCNA鑒定了與鹽脅迫響應和減輕其有害影響至關重要的關鍵基因和TF。SA的有益效果取決于其濃度、生理指標測量和轉錄組學數據已被廣泛研究。總體而言，向日葵在1 mM SA處理下表現最好。我們的研究結果表明，SA有潛力作為生長調節劑，增強向日葵對鹽脅迫的反應，這為制定旨在優化鹽堿地利用的環境友好且具有成本效益的策略奠定了基礎。
參考文獻：
Liu, A., Wang, M., Dong, J., Yan, Z., Wang, X., Li, J., & Song, H. (2024). Foliar application of exogenous salicylic acid mitigates the detrimental effects caused by salt stress in sunflower seedlings. Industrial Crops and Products, 222, 119854.
原文鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669024018314?via%3Dihub
