2024-11-01
文章題目
Microenvironment-responsive metal-phenolic network release platform with ROS scavenging, anti-pyroptosis, and ECM regeneration for intervertebral disc degeneration
技術(shù)手段
RNA-seq、SEM、免疫熒光、qPCR、Western Blot等
中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院在國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《Bioactive Materials》發(fā)表了關(guān)具有ROS清除、抗焦亡和ECM再生的微環(huán)境響應(yīng)型金屬酚網(wǎng)絡(luò)釋放平臺用于椎間盤退變治療研究的相關(guān)文章，在IVDD大鼠模型中，TMP@Alg-PBA/PVA通過減緩疾病進(jìn)展表現(xiàn)出優(yōu)異的治療效果，解釋了該平臺具有治療IVDD的臨床潛力。本研究中轉(zhuǎn)錄組測序及部分分析均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
01、研究背景
椎間盤退變(IVDD)可由衰老、損傷和遺傳因素引起。與IVDD相關(guān)的病理變化包括活性氧(ROS)的過度積累、細(xì)胞焦亡和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解。盡管目前臨床上有很多新技術(shù)用來治療和緩解IVDD帶來的癥狀，但是這些方法都是治標(biāo)不治本。該研究提供了TMP@Alg-PBA/PVA通過按需釋放NPs清除ROS、抑制細(xì)胞焦亡和減少ECM降解來協(xié)同治療IVDD的臨床潛力的證據(jù)。
02、技術(shù)路線
03、研究內(nèi)容
1.IVDD組織標(biāo)本病理變化的觀察
我們研究了椎間盤退變（IVDD）的病理變化，發(fā)現(xiàn)隨著退變進(jìn)展，髓核組織脫水加劇，T2加權(quán)MRI信號減弱，椎間隙變窄或消失。紅O-快綠染色和HE染色顯示細(xì)胞數(shù)量減少、ECM紊亂及纖維化增加。免疫組化和半定量分析表明，高Pfirrmann分級的退變IVD組織中II型膠原和聚集蛋白表達(dá)顯著降低，提示水分喪失和纖維化病變。焦亡相關(guān)蛋白NLRP3炎性小體、caspase-1和IL-1β在V級和IV級退變組織中表達(dá)較高，而在III級中最低，表明焦亡促進(jìn)IVDD進(jìn)展。活性氧（ROS）與焦亡和ECM降解密切相關(guān)，在IVDD發(fā)展中起重要作用，清除ROS對治療IVDD至關(guān)重要。
圖1 臨床退行性IVD標(biāo)本的病理改變
2.TMP NPs的表征
通過Mn2?與單寧酸（TA）自組裝，構(gòu)建了TA-Mn（TM）配合的金屬多酚網(wǎng)絡(luò)，并用PVP修飾TM表面，得到穩(wěn)定的TMP NPs溶液。FTIR驗(yàn)證了合成結(jié)果，熱重分析顯示TMP NPs中有機(jī)組分含量超過73.2%，表明高藥物負(fù)載。全掃描光譜證實(shí)TMP NPs主要由碳、氧、氮和錳組成。合成的TMP金屬多酚網(wǎng)絡(luò)具有低Mn2?濃度，降低了潛在的金屬毒性。研究表明，Mn2?釋放可加速膠原循環(huán)和ECM重塑。綜上，TMP合成具有低毒性、高載藥量、在多種溶液環(huán)境下穩(wěn)定且藥物降解慢。
圖2 TMP NPs的合成與表征
3.TMP NPs清除ROS的活性
研究了TMP NPs的ROS清除能力，使用ABTS和DPPH探針檢測發(fā)現(xiàn)，100 μg/mL TMP NPs可清除超過70%的自由基，表明其具有濃度依賴性的自由基清除能力。?OH和O2??清除實(shí)驗(yàn)也證實(shí)TMP NPs能降低這些自由基。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，隨著TMP NPs濃度增加，ROS逐步被清除，進(jìn)一步證實(shí)了其強(qiáng)ROS清除能力。JC-1實(shí)驗(yàn)表明，NPs還能提高線粒體活性。圖3 TMP NPs清除ROS的活性
圖3 TMP NPs清除ROS的活性
4.TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠釋放平臺的表征
為防止注射到IVD內(nèi)的溶液流向周圍關(guān)鍵區(qū)域，設(shè)計(jì)了一種微環(huán)境響應(yīng)釋放平臺，以在退化區(qū)域局部釋放NPs，并在健康組織中保持穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)按需和有效的藥物遞送。我們將TMP與PVA混合形成TMP@PVA，加入Alg-PBA快速成凝膠。掃描電鏡和能譜分析證實(shí)了TMP NPs的成功負(fù)載和均勻分布。自愈合實(shí)驗(yàn)顯示水凝膠可在15分鐘內(nèi)重新連接。降解試驗(yàn)表明，水凝膠對ROS刺激有響應(yīng)，加入H2O2后NPs累積釋放量顯著增加。總之，該釋放平臺有望用于IVD注射。
圖4 TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠釋放平臺的表征
5.TMP NPs的細(xì)胞攝取、溶酶體逃逸和線粒體積累
納米顆粒（NPs）的細(xì)胞攝取效率對治療效果至關(guān)重要。我們將CY5熒光標(biāo)記的TMP NPs加載到水凝膠中，發(fā)現(xiàn)隨著NPs濃度增加，細(xì)胞攝取逐漸增加，但超過200 μg/mL后不再顯著增加。共培養(yǎng)時間越長，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度也逐漸增加，流式細(xì)胞儀結(jié)果一致。TMP NPs在NPCs中表現(xiàn)出快速攝取和長時間保留，適合即時細(xì)胞治療和長期保護(hù)。Mito-tracker熒光標(biāo)記顯示NPs與線粒體有顯著正相關(guān)關(guān)系。總之，NPs被細(xì)胞吸收后通過溶酶體逃逸釋放到胞漿中，靶向線粒體，促進(jìn)TMP更有效地清除ROS。
圖5 TMP NPs的細(xì)胞攝取、溶酶體逃逸和線粒體積累
6.TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠釋放平臺對體外焦亡的影響
我們假設(shè)TMP@Alg-PBA/PVA可以抑制細(xì)胞焦亡，并進(jìn)行了研究。使用40 ng/mL IL-1β誘導(dǎo)NPCs焦亡，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示TMP@Alg-PBA/PVA組的細(xì)胞活力顯著高于對照組和Gel組。IL-1β處理后，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加，而TMP@Alg-PBA/PVA處理后無顯著變化。LDH檢測顯示，TMP@Alg-PBA/PVA組的LDH水平降低，表明細(xì)胞膜破裂減少。SEM觀察顯示，IL-1β組細(xì)胞膜孔洞增多，而治療組細(xì)胞形態(tài)保持完整。RT-qPCR、免疫熒光和Western blot分析顯示，治療組中IL-1β、TNF-α及NLRP3、caspase-1、GSDMD-N的表達(dá)顯著降低。綜上所述，TMP@Alg-PBA/PVA有效抑制細(xì)胞焦亡。
圖6 TMP@Alg-PBA/PVA對焦亡的影響
7.TMP@Alg-PBA/PVA抑制焦亡的潛在機(jī)制
盡管已驗(yàn)證TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠具有抗焦亡特性，但具體機(jī)制尚不清楚。通過高通量mRNA測序，我們發(fā)現(xiàn)兩組間有2967個差異表達(dá)基因（DEGs），其中1472個上調(diào)，1495個下調(diào)。GO分析顯示這些DEGs主要與發(fā)育、細(xì)胞反應(yīng)、分化和ECM相關(guān)。KEGG通路富集分析顯示，TNF信號通路、IL-17信號通路、細(xì)胞周期和Toll樣受體信號通路在治療組中被下調(diào)，特別是IL-17信號通路顯著抑制。Western Blot分析顯示，添加IL-17抑制劑后，IL-17/ERK信號通路及其下游焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)減弱。本研究首次揭示了IL-17/ERK信號通路在IVDD中促進(jìn)焦亡的作用。在IL-1β處理的NPCs中，IL-17A、MEK、pMEK等蛋白水平升高，而添加抑制劑和TMP@Alg-PBA/PVA后，這些效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)，焦亡減少。綜上所述，TMP@Alg-PBA/PVA可能通過抑制NPCs中的IL-17/ERK信號通路來減少細(xì)胞焦亡，為IVDD治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。
圖7轉(zhuǎn)錄組測序及分析
8.TMP@Alg-PBA/PVA治療后ECM的變化
IVDD的主要特征是水分子丟失、ECM降解、纖維化增加及椎間盤機(jī)械損傷。減少ROS積累和細(xì)胞焦亡可減輕ECM降解，TMP@Alg-PBA/PVA平臺釋放的Mn2+可能為NPCs提供局部Mn2+環(huán)境，加速膠原蛋白循環(huán)，促進(jìn)ECM重塑。我們利用IL-1β刺激NPCs模擬炎癥環(huán)境對ECM的影響。結(jié)果顯示，IL-1β處理后，聚集蛋白和Col-II的熒光強(qiáng)度顯著降低，表明IL-1β嚴(yán)重?fù)p害了NPCs重塑ECM的能力。RT-qPCR和WB實(shí)驗(yàn)顯示，TMP@Alg-PBA/PVA處理有效降低了ECM降解酶（如MMP-3和MMP-13）的表達(dá)，并恢復(fù)了聚集蛋白和Col-II的表達(dá)。這些結(jié)果表明，TMP@Alg-PBA/PVA平臺能有效抵消IL-1β對ECM的有害影響，顯示出在IVD修復(fù)和再生中的潛力。
圖8 炎癥環(huán)境中TMP@Alg-PBA/PVA對ECM的影響
9.TMP@Alg-PBA/PVA對il -1β誘導(dǎo)的大鼠IVDD模型的影響
為了評估TMP@Alg-PBA/PVA在體內(nèi)的療效，我們通過IL-1β誘導(dǎo)大鼠IVDD，并在注射后3天進(jìn)行干預(yù)。我們在IVDD大鼠體內(nèi)原位注射10 μL的TMP@Alg-PBA/PVA釋放平臺。4周和8周后，影像學(xué)分析顯示，PBS組和Gel組的DHI顯著下降且骨贅形成增加，表明這兩種處理未能有效減輕IVDD。然而，添加含有200 μg/mL TMP NPs的高劑量組和100 μg/mL TMP NPs的低劑量組后，DHI下降速度減緩。高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組，表明該平臺對IVDD有顯著療效。MRI顯示，高劑量組的髓核含水量增加，進(jìn)一步證實(shí)了TMP@Alg-PBA/PVA在治療IVDD中的關(guān)鍵作用。
圖9 動物實(shí)驗(yàn)的影像學(xué)評價
10.組織染色和免疫組織化學(xué)
我們對IVDD大鼠尾部退變組織進(jìn)行切片和染色。HE染色顯示，PBS組和Gel組出現(xiàn)顯著的組織結(jié)構(gòu)喪失、髓核萎縮及纖維化，而高劑量和低劑量TMP@Alg-PBA/PVA組保持了清晰的組織邊界和軟骨終板形態(tài)。番紅O-快綠染色顯示，PBS組和Gel組髓核減少并伴有纖維化，而TMP@Alg-PBA/PVA組維持了纖維環(huán)和髓核的邊界。免疫組化結(jié)果顯示，TMP@Alg-PBA/PVA組中Col-II和聚集蛋白表達(dá)顯著增加，表明該平臺有效減輕ECM降解并維持IVD含水量。
圖10 IVDD大鼠尾巴的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析
11.TMP@Alg-PBA/PVA在體內(nèi)治療IVDD的作用機(jī)制
為了評估TMP@Alg-PBA/PVA通過減輕細(xì)胞焦亡緩解IVDD的潛力，我們對IVD髓核組織進(jìn)行了免疫熒光染色。Caspase-1用紅色標(biāo)記，GSDMD用綠色標(biāo)記。假手術(shù)組和高劑量組中這兩種蛋白幾乎不表達(dá)，而低劑量組略有增加，Gel組和PBS組則顯著增強(qiáng)，表明焦亡加劇。熒光半定量分析顯示，高劑量組由于TMP負(fù)載量高，抗焦亡效果更佳。這些結(jié)果表明，TMP@Alg-PBA/PVA平臺可通過減輕細(xì)胞焦亡減緩IVDD進(jìn)展。
圖11 TMP拯救大鼠IVDD的分子機(jī)制
04、結(jié) 論
在本研究中，我們開發(fā)了多功能且微環(huán)境響應(yīng)的金屬酚網(wǎng)絡(luò)釋放平臺（TMP@Alg-PBA/PVA），裝載的TMP納米顆粒可按需釋放以清除ROS。體外和體內(nèi)研究表明，該平臺能有效靶向線粒體、減少細(xì)胞焦亡、抑制ECM降解，并增加IVD含水量。該平臺通過抑制IL-17/ERK信號通路，為IVDD治療提供了一種優(yōu)秀的抑制焦亡的方法。盡管已有類似平臺報(bào)道，但TMP@Alg-PBA/PVA具有按需釋放和多方面作用的優(yōu)勢，顯示出治療IVDD的潛力，值得進(jìn)一步臨床前研究。
原文索引：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.02.036
