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IF=5.2!細(xì)菌完成圖+比較基因組揭秘IncM1質(zhì)粒在耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中的高傳播率

2024-09-08

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近日，武漢大學(xué)中南醫(yī)院在《communications biology》期刊發(fā)表新研究成果！本研究闡明了攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基因的超易傳播的lncM1質(zhì)粒pKPC_NDM在序列型1049 K_locus 5 (ST1049-KL5) KPC_NDM_CRKP分離株中的流行情況。這項(xiàng)研究總結(jié)了KPC_NDM_CRKP暴發(fā)的特點(diǎn)，并強(qiáng)調(diào)了持續(xù)監(jiān)控和感染控制策略的重要性，以及應(yīng)對(duì)ST1049型肺炎克雷伯菌所帶來的挑戰(zhàn)。

本研究的測(cè)序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。


1、研究背景

肺炎克雷伯菌是一種重要的機(jī)會(huì)致病菌，可導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率。碳青霉烯耐藥的多種機(jī)制涉及碳青霉烯酶的產(chǎn)生，其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)是最常見的兩種類型。KPC和NDM碳青霉烯酶的共同產(chǎn)生已被廣泛記錄在各種腸桿菌科物種中，這些細(xì)菌對(duì)幾乎所有常用的β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合和碳青霉烯類具有耐藥性。雖然氨基糖苷類、粘菌素和替加環(huán)素等替代治療方案可能有效，但與這些藥物相關(guān)的腎毒性和死亡率增加的潛在風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。


2、研究材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：9株產(chǎn)KPC和NDM碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，其中包括4株ST1049 KPC_NDM_CRKP和5株ST11 KPC_NDM_CRKP

2.測(cè)序平臺(tái)：Pacbio +Illumina

3.分析內(nèi)容：細(xì)菌完成圖、比較基因組圈圖、（easyfig）遺傳環(huán)境分析、cgMLST聚類、cgSNP進(jìn)化樹構(gòu)建、藥敏試驗(yàn)、基因編輯、共軛和適應(yīng)度評(píng)價(jià)等等。



3、研究結(jié)果

肺炎克雷伯菌分離株的克隆和遺傳相關(guān)性

脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析顯示除KP4007菌株外，所有ST1049型肺炎克雷伯菌分離株之間具有高度克隆相關(guān)性。菌株KP1527、KP2094和KP1078表現(xiàn)出相同的電泳條帶，與初始分離株KP3594僅相差兩個(gè)條帶，表明ST1049型肺炎克雷伯菌在本院內(nèi)的克隆傳播。cgSNP系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，顯示ST1049 KPC_NDM_CRKP菌株之間存在緊密的遺傳關(guān)系，SNP變異最小。相比之下，盡管ST11 KPC_NDM_CRKP群在系統(tǒng)發(fā)育圖譜中表現(xiàn)出遺傳同源性，但在PFGE模式上顯示了克隆異質(zhì)性。

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圖1 臨床肺炎克雷伯菌克隆及遺傳親緣關(guān)系分析

ST1049 KPC_NDM_CRKP質(zhì)粒的比較基因組分析

全基因組測(cè)序顯示KPC_NDM_CRKP分離株抗藥性和毒力基因譜多樣性。blaKPC-2基因位于IncFII/IncR質(zhì)粒，而blaNDM-1在IncN或IncC質(zhì)粒中。ST1049分離株攜帶76,517 bp的IncM1質(zhì)粒pKPC_NDM，含blaKPC-2、blaNDM-1和qnrS1基因；一個(gè)IncFII(K)多重耐藥質(zhì)粒；以及編碼毒力因子的IncFIB質(zhì)粒。pVIR1527質(zhì)粒包含高毒力質(zhì)粒pLVPK和pK2044的毒力基因，與KPN55602的pK55602_1高度相似。pKPC_NDM與CRKP_35_unnamed4相同。其他IncM1質(zhì)粒攜帶blaKPC-2或blaCTX-M-3基因，pKPC_NDM1527含接合相關(guān)移動(dòng)遺傳元件。pKPC_NDM與NCBI數(shù)據(jù)庫中質(zhì)粒比較，顯示blaKPC-2的保守性，blaNDM-1的多樣性。具體來說，pKPC_NDM中的blaKPC-2區(qū)域與之前報(bào)道的在pKpc-LKEC中鑒定的NTEKPC-Id結(jié)構(gòu)相似，而blaNDM-1區(qū)域與IncN質(zhì)粒pNDM1-CBG具有最高相似性。

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圖2 質(zhì)粒比較基因組分析

接合子/轉(zhuǎn)化子的特性驗(yàn)證以及pKPC_NDM的轉(zhuǎn)移能力

pKPC_NDM從供體ST1049 KPC_NDM_CRKP菌株向受體大腸桿菌EC600的成功轉(zhuǎn)移顯示了比ST11 KPC_NDM_CRKP攜帶的blaKPC-2或blaNDM-1質(zhì)粒更高的傳輸頻率。pKPC_NDM還可以從ST1049 KPC_NDM_CRKP轉(zhuǎn)移到對(duì)碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌對(duì)照菌株K. pneumoniae ATCC 700603，并從供體大腸桿菌EC600::pKPC_NDM轉(zhuǎn)移到ST1049 CSKP受體。同時(shí)試驗(yàn)驗(yàn)證了野生株及其攜帶pKPC_NDM的接合子/轉(zhuǎn)化子共同產(chǎn)生KPC和NDM碳青霉烯酶。值得注意的是，氨曲南（ATM）和頭孢他啶/阿維巴坦（CAZ/AVI）紙片之間的幽靈區(qū)暗示了對(duì)攜帶pKPC_NDM菌株的協(xié)同作用。

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圖3 使用APB/EDTA增強(qiáng)方法進(jìn)行碳青霉烯酶表型確認(rèn)

對(duì)來源于pKPC_NDM的oriT與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，結(jié)果顯示其與來自廣宿主范圍接合質(zhì)粒pCTXM-360的oriT_pCTXM360具有最高相似性。進(jìn)一步與從NCBI中檢索出的90個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行比較，所有這些質(zhì)粒具有相同的oriTKN位點(diǎn)，表明oriTKN與IncM1接合質(zhì)粒之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，其在IncM1質(zhì)粒傳播中的關(guān)鍵作用。此外，oriTKN的插入促進(jìn)了pUCP24從大腸桿菌S17到大腸桿菌EC600和肺炎克雷伯菌ATCC 700603的自發(fā)接合。

pKPC_NDM受體中的穩(wěn)定性、不相容性及碳青霉烯抗性維持

質(zhì)粒穩(wěn)定性和適應(yīng)性測(cè)試結(jié)果顯示，當(dāng)pKPC_NDM通過接合引入到ST1049 CSKP受體和大腸桿菌EC600中時(shí)，經(jīng)過連續(xù)10天的傳代后，其保留率超過80%，且這種穩(wěn)定性并未損害其適應(yīng)性。碳青霉烯抗性維持結(jié)果表明，在傳代過程中128株大腸桿菌受體中有3.9%和128株肺炎克雷伯菌受體中有2.3%失去了碳青霉烯抗性，并且所有這些菌株都失去了整個(gè)pKPC_NDM質(zhì)粒。有趣的是，有一個(gè)特定的接合子保持了降低的碳青霉烯抗性但失去了對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦（CAZ/AVI）的抗性，測(cè)序結(jié)果顯示該接合子失去了blaNDM-1基因區(qū)域。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)成功地使用CRISPR-Cas9方法敲除了blaKPC-2基因，但是嘗試敲除blaNDM-1基因?qū)е铝苏麄€(gè)pKPC_NDM質(zhì)粒在宿主菌株中的丟失。此外，含有KPC或NDM區(qū)域缺失的質(zhì)粒與pKPC_NDM相比，在接合效率上沒有顯著差異。在不相容性測(cè)試中，pKPC_NDM與KPC-或NDM產(chǎn)生的CRKP菌株中存在的IncFII/IncR blaKPC-2和IncN或IncC blaNDM-1質(zhì)粒相容，在不含抗生素的平板上培養(yǎng)后，所有轉(zhuǎn)化子菌落都保留了pKPC_NDM以及攜帶blaKPC-2或blaNDM-1的質(zhì)粒。

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

KPC_NDM_CRKP菌株對(duì)臨床使用的β-內(nèi)酰胺類抗生素均表現(xiàn)出抗性，包括頭孢菌素、單環(huán)β-內(nèi)酰胺、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合以及碳青霉烯類抗生素。然而，它們對(duì)多粘菌素B和替加環(huán)素仍保持敏感，并且對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類和復(fù)方磺胺甲噁唑顯示不同的抗性模式。雖然CAZ/AVI的有效性有限，但AVI與ATM或美西林（MEC）的聯(lián)合療法對(duì)抗KPC_NDM_CRKP菌株顯示出顯著改善。此外，當(dāng)刪除攜帶blaKPC或blaNDM的區(qū)域時(shí)，觀察到碳青霉烯MIC值降低了兩倍。

致病性評(píng)估和時(shí)間殺滅試驗(yàn)結(jié)果

大多數(shù)KPC_NDM_CRKP分離株對(duì)人血清表現(xiàn)出高度敏感性。然而，ST1049肺炎克雷伯菌的整體生物膜產(chǎn)量顯著高于ST11肺炎克雷伯菌菌株。雖然ST1049 KPC_NDM_CRKP和CSKP組之間在生物膜形成能力方面沒有顯著差異，前者表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗血清殺菌能力。時(shí)間殺滅試驗(yàn)顯示單獨(dú)使用CAZ/AVI、ATM或MEC對(duì)KPC_NDM_CRKP菌株的體外療效有限，而聯(lián)合療法顯示出協(xié)同效應(yīng)。

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圖4臨床肺炎克雷伯菌致病性特征及時(shí)間殺傷曲線

核心基因組多位點(diǎn)序列分型（cgMLST）分析

對(duì)23株ST1049菌株和115株其他序列類型的KPC_NDM_CRKP菌株在內(nèi)的肺炎克雷伯菌基因組進(jìn)行cgMLST分析。分析表明ST1049流行主要局限于中國地區(qū)，并且在KPC_NDM_CRKP菌株之間表現(xiàn)出顯著的多樣性。KPC_NDM_CRKP的流行包括幾個(gè)成功的克隆，這表明其基因組和地理上的異質(zhì)性。有趣的是，ST1049 KPC_NDM_CRKP的爆發(fā)最初且僅在我院觀察到。

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圖5 cgMLST分析


4、結(jié) 論

攜帶同時(shí)含有blaKPC-2和blaNDM-1基因的IncM1質(zhì)粒pKPC_NDM的ST1049-KL5型碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的出現(xiàn)及其克隆傳播提出了嚴(yán)峻的公共健康問題。本研究強(qiáng)調(diào)了ST1049菌株作為高毒力和多重耐藥質(zhì)粒載體的潛力，突顯了持續(xù)監(jiān)測(cè)和實(shí)施有效感染控制策略的重要性。


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文章索引：

Liu, Hongmao, et al. "Prevalence of ST1049-KL5 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with a blaKPC-2 and blaNDM-1 co-carrying hypertransmissible IncM1 plasmid." Communications Biology 7.1 (2024): 695.





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