2024-09-01
文章題目：Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae capsular types, antibiotic resistance and virulence factors in China: a longitudinal, multi-centre study 技術(shù)手段：RNA-seq、全基因組測序、q-PCR、宏基因組 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院在國際著名雜志《Nature microbiology》發(fā)表了關(guān)于中國耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌莢膜類型、抗生素耐藥性和毒力因素縱向多中心研究的相關(guān)文章，揭示了CRKP血清型的流行和動態(tài)且監(jiān)測血清型變化對未來開發(fā)針對CRKP感染的免疫策略的重要性。本研究中轉(zhuǎn)錄組測序及部分分析均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
01、研究背景 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)由于其多重耐藥性質(zhì)和感染高死亡率已成為對公眾健康的嚴(yán)重威脅。根據(jù)2023年中國抗微生物藥物監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)(CHINET)的數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌已成為中國臨床第二大分離細(xì)菌，耐藥率從2005年的2.9%穩(wěn)步上升至2023年的30.0% 。耐藥性的增加反過來限制了治療選擇，并增加了對控制CRKP感染的新策略的需求。
02、技術(shù)路線
03、研究內(nèi)容 1.CRKP分離株莢膜及其抗菌特性分析 2016-2020年，從中國26個省或直轄市的40家醫(yī)院收治的肺炎克雷伯菌感染的成年患者中共收集了1017株非重復(fù)的CRKP分離株，這些分離株中大多數(shù)都是blaKPC-2，同時鑒定出18株非產(chǎn)碳青霉烯酶的CRKP分離株。莢膜基因分型發(fā)現(xiàn)58個不同的K位點(diǎn);K型以KL64型和KL47型居多。這兩種K型的出現(xiàn)頻率隨時間和地理的變化而變化。KL64從2016年的35.0%顯著增加到2020年的59.6%，同時KL47從42.3%下降到17.8%（圖1a）。KL64主要分布在中國東部和中部，而KL47主要分布在中國北部和東北部。通過測序展示了不同K型菌株在抗菌藥物敏感性表型及碳青霉烯酶基因分布上的差異。排名前七的K型菌株主要與blaKPC-2基因相關(guān)，這些菌株對頭孢他啶-阿維巴坦（CZA）敏感，但對阿米卡星耐藥（除KL19外）（圖1c）。 圖1 2016-2020年中國26個省市CRKP分離株莢膜基因型及抗菌譜分析 2.CRKP分離株中與毒力相關(guān)的基因攜帶情況 在所有CRKP分離株中通篩選了5個高毒力相關(guān)基因，并將413株同時攜帶iucA和rmpA/rmpA2基因的分離株分類為高毒力CRKPs (hv-CRKPs)，其中31株同時攜帶5個高毒力相關(guān)基因。在前10個k型菌株中，KL60含hv-CRKP菌株的比例最高（圖2a）,hv-CRKP的比例從2016年的28.2%上升到2020年的45.7%，KL47的hv-CRKP水平增加了三倍，相比之下KL64中hv-CRKP的頻率保持穩(wěn)定（圖2b）,這種變換趨勢主要與在KL64和KL47菌株中與毒力相關(guān)的質(zhì)粒有關(guān)（圖2c）。 圖2 CRKP菌株AMR及高毒力相關(guān)基因的分布 3.中國KL47和KL64型CRKP的基因組流行病學(xué)研究以及L1 - CRKP在中國的時空傳遞 為了獲得兩種最常見的k型CRKP的系統(tǒng)發(fā)育概況，本文對207株KL47和319株KL64進(jìn)行了全基因組測序，發(fā)現(xiàn)其中>99%(523/526)屬于ST11類型，基于kleborate預(yù)測，發(fā)現(xiàn)ST11的44個K型和6個O型具有很強(qiáng)的相關(guān)性，其中L1的相關(guān)性最強(qiáng)。ST11中最常見的碳青霉烯酶是blaKPC-2，其次是blaOXA-48和blaNDM-1(圖3a)。基于上述系統(tǒng)發(fā)育，利用BactDating估計(jì)了L1譜系的時空動態(tài)，推測了L1的最近共同祖先在1983年之前出現(xiàn)在血清型KL47:OL101中，而KL64:O2血清型估計(jì)在2003年出現(xiàn)，值得注意的是，本文還預(yù)測了L1中的其他14個K基因型，其中一些形成了局部聚集（圖3b）。通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)北京和上海是兩個主要傳播源（圖3c和d）。 圖3 ST11菌株的群體結(jié)構(gòu)和L1系的傳播模式 4.在KL64和KL47分離株中存在非莢膜的CRKP 所有經(jīng)基因分型鑒定為KL64或KL47的分離株均進(jìn)行血清學(xué)分型，分別有7.4%(38/513)的KL64和12.2%(32/263)的KL47分離株在Quellung反應(yīng)中不與相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)，這些分離株呈半透明狀，多糖膠囊脲醛酸顯著減少(圖4a)，電鏡下證實(shí)為NEKp菌株(圖4b)。NEKp的頻率在不同身體部位的樣本之間也沒有顯著差異（圖4c）。NEKp菌株的cps區(qū)或rfaH基因存在多種突變，包括插入序列(ISs)、點(diǎn)突變和缺失，主要影響初始糖基轉(zhuǎn)移酶基因（圖4d）。此外，對49份未經(jīng)處理的CRKP感染臨床樣本進(jìn)行了宏基因組測序。在11個覆蓋率大于5倍的樣本中，有3個樣本的cps基因被破壞，這證明了體內(nèi)存在莢膜缺陷的突變（圖4e）。 圖4 臨床分離株中莢膜缺陷的情況 5.在感染下NEKp菌株的特性分析 在體外和體內(nèi)比較了NEKp/莢膜缺陷菌株和EKp(莢膜肺炎克雷伯菌)菌株，以評估莢膜合成對適應(yīng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，莢膜缺陷菌株生物膜生成增加，同時對巨噬細(xì)胞吞噬的敏感性更高（圖5a-c）。小鼠腹膜內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)表明，同基因型的Δcps突變株相比于其親本EKp菌株，在致死率及向肺部、肝臟和脾臟擴(kuò)散的競爭能力方面均有所減弱（圖5d-h）。 圖5 評估莢膜合成對體外及體內(nèi)適應(yīng)性影響的效果 出人意料的是，血清殺菌實(shí)驗(yàn)揭示NEKp菌株中耐血清株的比例高于EKp菌株（圖6a）,此外，我們發(fā)現(xiàn)除O-抗原陰性株外，與去莢膜的EKp菌株相比，同基因型Δcps突變株表現(xiàn)出更強(qiáng)的血清耐受性和增強(qiáng)的O抗原表達(dá)。通過比較親本EKp菌株、莢膜多糖降解酶處理過的（去莢膜）EKp菌株、同基因型Δcps及ΔcpsΔops突變株的抗血清能力，證明了莢膜多糖（CPS）與O-抗原多糖（OPS）在抵抗血清殺傷中都起著關(guān)鍵作用（圖6b）。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及RT-PCR也顯示（圖7），相較于親本菌株，Δcps突變株中LPS和肽聚糖合成相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明，莢膜合成的破壞增強(qiáng)了O-抗原的合成，最終提高了對抗血清的能力。此外，在血清殺菌活性（SBA）試驗(yàn)中，突變株對從感染克雷伯氏肺炎菌KL47/KL64的患者體內(nèi)收集的熱滅活血清顯示出更高的抵抗力，這提示莢膜耗竭可能是逃避體液免疫反應(yīng)的一種潛在機(jī)制（圖6c）。總體而言，NEKp菌株通過增強(qiáng)生物膜形成、提高血清耐受性和抗血清殺菌活性展現(xiàn)出適應(yīng)性優(yōu)勢，但在傳播能力和抗吞噬作用上存在缺陷（圖6d）。 圖6 NEKp菌株在感染壓力下具有生存優(yōu)勢 圖7 WT和Δcps菌株的RNA測序和qPCR
04、結(jié) 論 本文描述了中國為期五年的多中心CRKP相關(guān)感染監(jiān)測，并全面概述了CRKP菌株的莢膜、耐藥性以及關(guān)鍵毒力特征的分布與演變情況。同時，還闡述了一種CRKP的平衡進(jìn)化過程，這一過程導(dǎo)致臨床樣本中維持了中等但相對穩(wěn)定的無莢膜及O-抗原缺失菌株水平。
原文索引： https://doi. org/10.1016/j.scitotenv.2024.171457
