文章題目：LSD1 promotes the FSH responsive follicle formation by regulating autophagy and repressing Wt1 in the granulosa cells
中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)在《Science Bulletin》上發(fā)表了LSD1通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞中的自噬和抑制Wt1來(lái)促進(jìn)FSH反應(yīng)性卵泡形成的研究成果，影響因子18.9。本研究中轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)及部分?jǐn)?shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
在生長(zhǎng)中的卵泡中，卵母細(xì)胞的存活和成熟很大程度上依賴于體細(xì)胞的支持，以促進(jìn)FSH誘導(dǎo)的相互信號(hào)傳導(dǎo)和化學(xué)通訊。盡管體細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡和自噬參與FSH誘導(dǎo)的卵泡發(fā)育過程，但其潛在機(jī)制需要大量研究。
表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、翻譯后組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控，可以獨(dú)立或協(xié)同影響細(xì)胞命運(yùn)。作者之前的研究表明，在胎兒卵巢卵母細(xì)胞中，LSD1調(diào)節(jié)自噬接頭p62的轉(zhuǎn)錄，并在小鼠原始卵泡形成過程中通過其H3K4me2去甲基化酶活性影響自噬。然而，目前尚不清楚GC中的LSD1是否在成人卵泡生長(zhǎng)的發(fā)育中起關(guān)鍵作用。
在FSH反應(yīng)階段，LSD1在GC中的表達(dá)增加
為了研究LSD1在小鼠卵泡發(fā)育過程中的生理作用，作者先明確了LSD1在FSH誘導(dǎo)的卵泡生長(zhǎng)過程中的表達(dá)。為了確定 LSD1 水平是否與促性腺激素誘導(dǎo)的激活相關(guān)，施用了功能類似于 FSH 的 PMSG 來(lái)刺激卵泡生長(zhǎng)。如圖1a所示，當(dāng)小鼠注射PMSG時(shí)，PMSG處理后24 h至36 h卵巢中LSD1的蛋白質(zhì)和mRNA水平均顯著增加，然后在48 h后略有下降。接下來(lái)，在PMSG注射后的不同時(shí)間點(diǎn)分離卵巢GC，通過WB分析研究卵泡發(fā)育過程中GC中LSD1的表達(dá)。此外，還對(duì)卵巢切片進(jìn)行了IHC 染色。簡(jiǎn)而言之，隨著卵泡的發(fā)育，PMSG處理后從12小時(shí)到36小時(shí)GCs中LSD1的表達(dá)水平逐漸增加（圖1b-c）。這些結(jié)果表明LSD1可能在竇卵泡(Afs)的形成中發(fā)揮重要作用。
圖1 GCs中LSD1表達(dá)的增加與小鼠卵泡發(fā)育階段有關(guān)
Lsd1的GC特異性敲除導(dǎo)致雌性小鼠生育能力低下
為了研究LSD1在生長(zhǎng)卵泡GC中的功能，通過雜交產(chǎn)生了具有GC特異性缺失Lsd1的小鼠模型Lsd1f/f；Foxl2-Cre。首先，在用PMSG和hCG誘導(dǎo)17小時(shí)后，評(píng)估Lsd1缺失對(duì)排卵的影響。與對(duì)照小鼠相比，Lsd1敲除小鼠排出成熟卵母細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖2a-b）。接著，作者研究了Lsd1被特異性刪除后雌性的生殖能力。評(píng)估Lsd1-null小鼠的生育能力，發(fā)現(xiàn)Lsd1f/f；Foxl2-Cre雌性在交配后七個(gè)月時(shí)未能產(chǎn)生后代（圖2c），這表明其生殖壽命顯著縮短并獲得不育表型。
鑒于Lsd1敲除小鼠的生育能力受損，作者又進(jìn)一步研究了生長(zhǎng)卵泡GC中Lsd1缺失對(duì)FSH的影響。注射PMSG后48 h，3周齡 Lsd1敲除小鼠的卵巢明顯小于對(duì)照小鼠（圖2d），且卵巢重量與體重的比值顯著降低（圖2e）。此外，WB（GCs樣本）和IF（卵巢樣本）證實(shí)了卵巢的敲除效率（圖2f-g）。根據(jù)組織學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析，在GCs中Lsd1缺失后，包括初級(jí)卵泡（PFs）和AFs在內(nèi)的生長(zhǎng)卵泡的數(shù)量顯著減少（圖2h-i）。
圖2 GCs中特異性敲除Lsd1導(dǎo)致低生育能力
為了研究LSD1在卵巢中的精確功能并排除GC特異性Lsd1敲除對(duì)原始卵泡池的可能影響，其可能會(huì)影響生長(zhǎng)卵泡的募集，通過雜交生成了一種具有GC特異性缺失Lsd1的新小鼠模型Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2，21-23天的小鼠接受PMSG注射以刺激卵泡生長(zhǎng)。48小時(shí)后，與相應(yīng)的對(duì)照小鼠相比，Lsd1敲除小鼠的卵巢大小和卵巢重量與體重之比明顯降低（圖3a-b）。此外，通過免疫印跡（GCs樣品）和IF（卵巢樣品）證實(shí)了敲除效率（圖3c-d）。組織學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠在卵巢中觀察到的AF數(shù)量可以忽略不計(jì)（圖3e）。此外，在PMSG處理后48小時(shí)通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析了GC中Lsd1條件敲除后蛋白質(zhì)水平的變化。然后，KEGG富集分析表明，Lsd1的耗竭導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著變化，與參與蛋白質(zhì)合成、雌激素產(chǎn)生等的信號(hào)通路有關(guān)（圖3f）。
為了更準(zhǔn)確地分析LSD1蛋白功能對(duì)卵泡發(fā)育的影響，作者對(duì)Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠注射PMSG 24 h后的樣品進(jìn)行了分析。出乎意料的是，Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠和Lsd1f/f小鼠的卵巢大小和卵巢重量體重比都非常相似(圖3g-h)，在任何發(fā)育階段的卵泡數(shù)量均無(wú)顯著差異(圖3k)，并且證實(shí)了基因敲除的有效性(圖3i-j)。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在此期間表現(xiàn)出表達(dá)變化的蛋白質(zhì)參與了與細(xì)胞代謝、激素反應(yīng)和細(xì)胞死亡相關(guān)的信號(hào)通路(圖3l)。總之，在小鼠GCs中敲除LSD1蛋白導(dǎo)致卵泡在高度依賴FSH的快速生長(zhǎng)期發(fā)育不正常。
圖3 LSD1對(duì)于從胃前到心房顫動(dòng)階段的過渡尤為重要
LSD1通過誘導(dǎo)GCs自噬促進(jìn)AFs的形成
為了研究LSD1蛋白缺失后卵泡發(fā)育的模式，收集了3周齡Lsd1f/f小鼠和Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠的卵巢，這些小鼠經(jīng)PMSG處理(48小時(shí))，冷凍并切片。采用結(jié)晶紫染色檢測(cè)卵泡形態(tài)，選擇含有多層GC的大SFs的GC進(jìn)行分析。LCM捕獲的卵泡GC用于轉(zhuǎn)錄組分析。通過KEGG分析和GSEA分析，與對(duì)照組小鼠相比，PMSG處理后48小時(shí)在Lsd1敲除小鼠中觀察到與細(xì)胞代謝、激素反應(yīng)、自噬和細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化（圖4a-c）。PMSG處理Lsd1敲除小鼠24或48小時(shí)后，自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著降低(圖4d)，IF和透射電子顯微鏡（TEM）結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Lsd1耗盡后大SFs的GC中的自噬水平受到顯著抑制(圖4e-f)。
為了進(jìn)一步研究Lsd1敲除對(duì)GCs自噬的影響，作者采用RFP-EGFP-LC3小鼠模型來(lái)研究Lsd1的缺失是否會(huì)影響自噬酶體的形成。結(jié)果表明，在PMSG處理48h后，LC3- Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2卵巢中GFP和RFP合并的熒光信號(hào)和單獨(dú)的RFP熒光信號(hào)都比對(duì)照卵巢弱。因此，自噬體在LC3- Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2卵巢中不能正常積累(圖4g-i)。綜上所述，這些結(jié)果再次證實(shí)了LSD1在生長(zhǎng)卵泡GCs中的表達(dá)，通過誘導(dǎo)自噬來(lái)促進(jìn)AFs的形成，以響應(yīng)FSH。
圖4 LSD1參與體內(nèi)自噬相關(guān)AFs的形成
首先，作者評(píng)估了生理?xiàng)l件下激素誘導(dǎo)的竇卵泡形成的變化。當(dāng)小鼠注射PMSG時(shí)，卵巢和GC中LC3的蛋白質(zhì)和mRNA水平隨著時(shí)間的推移而顯著增加。TEM顯示，與未處理的GC相比，PMSG處理的GC中存在更多的自噬體或自噬酶體。此外，F(xiàn)SHRs在卵巢和GC中的表達(dá)響應(yīng)PMSG啟動(dòng)以時(shí)間依賴性方式上調(diào)，而GC中H3K4me2的豐度逐漸降低。為了闡明GC中的自噬蛋白是否參與卵泡的周期性募集，3周齡小鼠腹膜內(nèi)注射PMSG和自噬抑制劑巴佛洛霉素A1（Baf-A1）。結(jié)果表明，AF的數(shù)量顯著減少，這表明自噬參與了AFs的發(fā)展（圖S5e-f）。值得注意的是，這些小鼠自噬抑制后AFs形成的失敗與上述兩種Lsd1敲除小鼠模型中觀察到的相似。因此，在生理?xiàng)l件下，竇卵泡的發(fā)育和周期性募集需要增加GC中的自噬。
為了證實(shí)LSD1通過自噬調(diào)節(jié)AFs的形成，作者利用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rap)來(lái)證實(shí)LSD1在誘導(dǎo)自噬中的作用。PMSG處理48小時(shí)后，Rap處理的Lsd1基因敲除小鼠卵巢略大于Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠卵巢,小鼠的卵巢重量與體重之比有所增加(圖5a)。此外，通過免疫印跡(GCs樣本)和IF(卵巢樣本)證實(shí)了基因敲除效率和自噬(圖5b-c)。與先前基于Baf-A1處理的結(jié)論一致，誘導(dǎo)自噬基因表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)Lsd1特異性敲除引起的AFs數(shù)量的顯著減少(圖5d-e)。綜上所述，LSD1通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)AFs的形成。
圖5 體內(nèi)自噬的激活逆轉(zhuǎn)了Lsd1缺失時(shí)AFs形成的減少
為了進(jìn)一步研究LSD1如何參與AFs形成相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，作者進(jìn)行了CUT&Tag的測(cè)定。數(shù)據(jù)分析表明，LSD1和H3K4me2在整個(gè)GC的基因啟動(dòng)子區(qū)域普遍存在（圖6a、b）。此外，GC顯示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）周圍H3K4me2和LSD1的豐度全局增加（圖6a-c）。此外，PMSG處理表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的基因與LSD1和H3K4me2共調(diào)控的基因顯著重疊（圖6d）。重疊的基因包括參與新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞死亡和激素合成的基因（圖6d）。
圖6 LSD1主要通過調(diào)節(jié)H3K4甲基化水平控制包括Wt1在內(nèi)的GC分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄
有趣的是，一些與自噬調(diào)節(jié)相關(guān)的基因也被富集。為了驗(yàn)證這些基因是否與自噬相關(guān)并與LSD1相關(guān)，作者進(jìn)行了ChIP-qPCR檢測(cè)。結(jié)果表明，LSD1和H3K4me2都直接與Atg16l2啟動(dòng)子中的4761至5160 bp區(qū)域結(jié)合（圖6e-h）。先前的研究表明，ATG16L2可作為競(jìng)爭(zhēng)性ATG16L1抑制劑，從而抑制自噬。此外，在作者的Lsd1敲除模型中，ATG16L2的mRNA和蛋白質(zhì)水平都有所增加（圖6i和7a）。這些結(jié)果表明，LSD1通過調(diào)節(jié)自噬抑制基因Atg16l2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)GCs中的自噬。
LSD1和H3K4me2調(diào)節(jié)GC中Wt1的轉(zhuǎn)錄以支持FSH反應(yīng)性
為了驗(yàn)證LSD1和H3K4me2如何調(diào)節(jié)WT1反應(yīng)性，進(jìn)行了ChIP-qPCR分析。結(jié)果表明，LSD1和H3K4me2都直接結(jié)合到Wt1啟動(dòng)子中2474 bp至2779 bp的區(qū)域（圖6j-m）。基于這些結(jié)果，假設(shè)LSD1和H3K4me2調(diào)節(jié)GC中Wt1的轉(zhuǎn)錄。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在GCs中敲除Lsd1后，WT1的蛋白和mRNA水平均升高，這證實(shí)了上述測(cè)序結(jié)果和與WT1相關(guān)的IHC結(jié)果（圖7a-b）。進(jìn)一步的證據(jù)表明，WT1在GC的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)。敲除Lsd1后，GC中WT1的蛋白水平升高（圖7d）。根據(jù)ChIP-qPCR分析，WT1直接與Fshr 啟動(dòng)子中的971至1282 bp區(qū)域結(jié)合（圖6n-o）。這表明WT1調(diào)控Fshr的轉(zhuǎn)錄活性。與這一假設(shè)一致，證實(shí)WT1的過表達(dá)顯著降低了Fshr的轉(zhuǎn)錄活性，并且FSHR表達(dá)在Wt1敲低后上調(diào)（圖7a）。因此，WT1有助于Fshr表達(dá)的下調(diào)，而響應(yīng)LSD1敲除的H3K4me2豐度增加可能促進(jìn)Wt1的轉(zhuǎn)錄。與之前的研究一致，作者的結(jié)果表明自噬參與了WT1降解的過程。根據(jù)本研究的免疫印跡和IHC結(jié)果，自噬的誘導(dǎo)導(dǎo)致WT1的快速降解（圖 7c-d）。因此，假設(shè)自噬通過促進(jìn)WT1降解來(lái)上調(diào)Fshr轉(zhuǎn)錄，以確保GC對(duì)FSH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最佳反應(yīng)。總之，LSD1缺陷導(dǎo)致的自噬抑制導(dǎo)致WT1降解失敗和AFs形成受損。
FSH影響LSD1在自噬中的調(diào)節(jié)作用
為了研究LSD1在GC中的功能及其與FSH誘導(dǎo)的關(guān)系，作者在KGN細(xì)胞中構(gòu)建了Lsd1敲除細(xì)胞系（Lsd1-KO）。WB結(jié)果顯示，LSD1在Lsd1-KO細(xì)胞中被成功敲除（圖7e）。KGN細(xì)胞中LSD1的缺失導(dǎo)致自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B II的蛋白質(zhì)水平升高（圖7e）。這表明GC中Lsd1的敲除會(huì)增加細(xì)胞自噬。然而，F(xiàn)SH處理后，Lsd1-KO細(xì)胞中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B的蛋白水平下調(diào)，自噬相關(guān)ATG16L2蛋白水平升高（圖7e）。這表明FSH處理后Lsd1-KO細(xì)胞的自噬被阻斷。Lsd1-KO細(xì)胞系的這些結(jié)果與小鼠GCs表型一致。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，LSD1介導(dǎo)的GC自噬變化可能與FSH刺激有關(guān)。因此，GC中Lsd1的敲除導(dǎo)致異常自噬，進(jìn)而影響GCs的發(fā)育，最終導(dǎo)致AFs形成失敗并最終導(dǎo)致發(fā)育異常。
圖7 LSD1和自噬共同下調(diào)GCs中WT1的水平，以支持FSH作用下進(jìn)行性AFs的形成
本研究為探究顆粒細(xì)胞中組蛋白去甲基化酶（LSD1）在有腔卵泡形成過程中的作用，構(gòu)建了該編碼基因的多種顆粒細(xì)胞條件性敲除小鼠和細(xì)胞模型。證明組蛋白去甲基化酶（LSD1）是調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞自噬及顆粒細(xì)胞分化的重要分子開關(guān)。LSD1參與調(diào)控FSH介導(dǎo)的有腔卵泡發(fā)育及卵泡命運(yùn)決定過程。一方面，敲除Lsd1會(huì)導(dǎo)致WT1的mRNA和蛋白水平積累，進(jìn)而下調(diào)顆粒細(xì)胞中FSH受體（FSHR）的表達(dá)，進(jìn)而抑制次級(jí)卵泡對(duì)FSH激素的響應(yīng)。另一方面，敲除Lsd1會(huì)導(dǎo)致顆粒細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Atg16l2的表達(dá)水平上調(diào)，從而抑制顆粒細(xì)胞自噬。該研究揭示了LSD1作為重要的表觀遺傳分子參與促性腺激素FSH調(diào)控雌性哺乳動(dòng)物有腔卵泡形成的分子機(jī)制。
原文索引：
Zhu Z, He M, Zhang T, Zhao T, Qin S, Gao M, Wang W, Zheng W, Chen Z, Liu L, Hao M, Zhou B, Zhang H, Wang J, Wang F, Xia G, Wang C. LSD1 promotes the FSH responsive follicle formation by regulating autophagy and repressing Wt1 in the granulosa cells. Sci Bull (Beijing). 2024 Apr 30;69(8):1122-1136. doi: 10.1016/j.scib.2024.01.015. Epub 2024 Jan 17. PMID: 38302330.
