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代謝組+16s聯合解讀:益生菌來源的細胞外囊泡緩解潰瘍性結腸炎

2024-07-01

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文章題目:  Lactobacillus plantarum-Derived Extracellular Vesicles Modulate Macrophage Polarization and Gut Homeostasis for Alleviating Ulcerative Colitis

技術手段:16s rRNA測序、非靶代謝組檢測、免疫組織學和qRT-PCR等

江蘇大學,龔愛華教授團隊在《Agicultural and Food Chemistry》上發表了16s rRNA測序,非靶代謝質譜檢測組學方法,闡明了LP-UJS來源的細胞外囊泡(LP-UJS-EVs)對小鼠潰瘍性結腸炎(UC)的免疫機制。

本研究的16s rRNA測序分析,非靶代謝組檢測分析和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。


研究背景

潰瘍性結腸炎(UC)是一種復雜的、動態的胃腸道疾病,UC的一個關鍵標志是腸道菌群組成的改變,專注于恢復腸道菌群平衡的策略是治療干預的關鍵方面。

近年來,益生菌胞外囊泡(EVs)在生物醫學上的應用引起了人們的極大興趣。最近的報道強調了植物乳桿菌衍生的EV的免疫調節和抗炎作用,表明了解這些EV在形成免疫反應中的作用是很重要的。此外,益生菌EVs除了影響免疫應答外,還具有調節腸道菌群和糾正腸道疾病的雙重作用。

本研究探討了L. plantarum UJS001 (LP-UJS)衍生EV ((LP-UJS-EVs)緩解UC的機制。根據我們的研究結果,LP-UJS-EV治療促進腸道屏障的修復,誘導巨噬細胞M2極化,上調白細胞介素-10 (IL-10)和轉化生長因子β (TGF-β)調節腸道菌群組成,影響賴氨酸代謝途徑。對EVs作用的探索為益生菌特別是其囊泡成分在UC治療中的應用提供了一個新的視角。

主要研究結果

1.LP-UJS的純化、鑒定及表征

本研究對菌株進行了初步純化和鑒定。利用特異性引物擴增分離菌株的16S rDNA,發現分離菌株與L的相似性為99%。此外,系統發育樹顯示,菌株LP-UJS001與L. plantarum在同一分支,因此被鑒定為L. plantarum(圖1D)。隨后,從LP-UJS培養上清液中通過過濾濃縮(FC)聯合超離心分離出EV。觀察到,LP-UJS-EV為球形雙層膜結構(圖1E),帶負電荷(圖1F),此外,以每1010個顆粒3mg /mL的濃度檢測LP-UJS-EV蛋白(圖1G)。經FC和離心處理后,獲得更高濃度的EV(圖1H)。

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圖1:LP-UJS的純化和鑒定


2.LP-UJS-EVs促進腸上皮細胞生長和巨噬細胞M2極化

為了探討不同濃度的LP-UJS-EVs在炎癥條件下對正常腸上皮細胞活性和巨噬細胞極化的影響。研究結果顯示,LP-UJS-EVs促進HCoEpiC和IEC-6細胞的生長呈濃度依賴性,并且根據巨噬細胞M2標志物CD163、IL-10、TGF-β 的mRNA水平變化量,確認了在0.3 mg/mL時效果最顯著(P < 0.05)(圖2)。

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圖2:LP-UJS-EVs促進腸上皮細胞生長和巨噬細胞m2極化


3.LP-UJS-EVs減輕DSS誘導的小鼠UC

為了研究LP-UJS-EVs對UC的影響,通過1周DSS誘導建立UC模型,并在模型建立后開始治療(圖3A)。

根據體重變化評分,DAI和結腸長度評估小鼠UC程度。從第5天到第10天,其他三組小鼠的體重均較對照組下降,其中DSS組體重下降最明顯(P < 0.0001)。從第11天到第14天,LP-UJS組和LP-UJS- EV組小鼠體重逐漸增加(P < 0.001)(圖3B),其中LP-UJS- EV組小鼠體重增加更為顯著(P < 0.05)。此外,DSS組的DAI評分高于其他三組。值得注意的是,LP-UJS-EVs組DAI評分略低于LPUJS組(P < 0.05)(圖3C)。

以上結果表明,LP-UJS和LP-UJS- ev均能有效治療UC,且LP-UJS- ev效果優于LPUJS。

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圖3:LP-UJS-EVs可減輕DSS誘導的小鼠UC


4.LP-UJS-EVs修復UC小鼠腸道屏障

本研究為了評估和比較LP-UJS-EVs處理對DSS誘導UC小鼠腸道屏障的影響,采用HE和Alcian染色進行組織學分析。

結果顯示,P-UJS和LP-UJS-EVs均能顯著恢復UC小鼠杯狀細胞的數量,改善結構破壞,減少炎癥細胞的浸潤(圖4A)。此外,免疫組化染色結果顯示,LPUJS和LP-UJS-EVs均能恢復ZO-1、cludin -1和ALPI的表達,修復組織損傷,且LP-UJS-EVs效果優于LP-UJS (P < 0.01)(圖4B)。血清FITC -葡聚糖4 (FD4)濃度表明,LP-UJS和LP-UJS-EVs均能顯著降低DSS引起的腸黏膜通透性增加(P < 0.01)(圖4C)。LP-UJS-EVs組大鼠血清IL-10、TGF-β濃度顯著高于DSS組(P < 0.01)。LP-UJS-EVs組IL-6、TNF-α、組胺水平明顯低于DSS組(P < 0.05)(圖4D-H)

綜上,LP-UJS和LP-UJS-EVs在降低炎癥引起的腸通透性增加、修復腸黏膜結構、抑制炎癥進展等方面均有顯著作用。并且LP-UJS-EVs的效果優于LP-UJS。

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圖4:LP-UJS-EVs修復UC小鼠腸道屏障


5.LP-UJS-EVs通過驅動巨噬細胞M2極化減輕腸道炎癥

觀察到LP-UJS-EVs對DSS誘導的 UC小鼠的治療作用與免疫應答之間的相關性,并觀察到LP-UJS-EVs治療UC小鼠MLNs中CD4+/CD8+ T細胞比例降低的逆轉(P < 0.05)(圖5A)。與DSS組相比,LP-UJS組和LP-UJS- ev組Treg細胞比例均降低(P < 0.01)。

進一步分析巨噬細胞比例,DSS組M1巨噬細胞較對照組顯著增加(P < 0.05)。LP-UJS和LP-UJS- ev治療后,M1巨噬細胞比例顯著降低(P < 0.01),且LP-UJS- ev組比LP-UJS組下降更明顯。相比于DSS組,CD163+ M2巨噬細胞的比例LP-UJS組和LP-UJS- EV組均顯著升高(P < 0.01),其中LP-UJS- ev組升高更為明顯(P < 0.001)。值得注意的是,LP-UJS-EVs組M2巨噬細胞的比例與對照組相比增加了約6倍,與DSS組相比增加了近3倍。這強調了驅動巨噬細胞M2極化是LP-UJS-EVs減輕UC小鼠炎癥的關鍵機制,且LP-UJS-EVs的效果優于LP-UJS (P < 0.05)(圖5C)。

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圖5:LP-UJS-EVs通過驅動巨噬細胞M2極化減輕腸道炎癥


6.LP-UJS-EVs對UC小鼠腸道菌群組成的影響

在確定了LP-UJS-EVs的免疫調節作用后,本研究試圖通過16S rRNA基因序列分析來研究它們對UC小鼠腸道微生物群的潛在影響。擬桿菌門和厚壁菌門是小鼠腸道中相對豐度最高的兩個門。與其他三組相比,DSS組Bacteroidetes與Firmicutes的比例最低,Verrucomicrobia的相對豐度最高,而LP-UJS-EVs組Chloroflexi的相對豐度最高(圖6A)。其次,通過β-多樣性分析分析不同組間的多樣性差異?;贐ray - Curtis指數的主坐標分析(PCoA)表明,DSS組與LP-UJS和LP-UJS-EVs組有顯著差異。PC1占總變化的29.8%,PC2占16.1%(圖6B)。此外,非度量多維尺度(NMDS)顯示出與PCoA結果相似的結果,應力值為0.091(圖6C)。值得注意的是,當應力小于0.2時,NMDS分析結果被廣泛認為是更可靠的。因此,PCoA和NMDS分析都是可靠的。

物種組成熱圖上看,DSS組Coprococcus、parabobacteroides、Staphylococcus、Odoribacter、Allobaculum和Turicibacter的豐度顯著高于對照組(P < 0.05)。LP-UJS-EVs治療導致Coprococcus、parabobacteroides、Staphylococcus和Allobaculum豐度顯著下降,恢復了與對照組相似的組成形式(圖6D,E)。

根據細菌標記基因單獨測序數據進一步預測功能單元組成,發現最豐富的三個功能通路是核苷和核苷酸生物合成、氨基酸生物合成以及輔因子、假基、電子載體和維生素生物合成(圖6G)。為了研究腸道菌群、炎癥物質和M1/M2巨噬細胞標志物蛋白表達之間的潛在相關性,相關性分析結果顯示,Prevotella和Clostridiaceae_Clostridium的豐度與TNF-α和CD86的表達呈負相關(P < 0.05), AF12的表達與TNF-α呈負相關(P < 0.05)。相反,副擬桿菌的豐度與組胺、IL-6、TNF-α、CD86的表達呈正相關(P < 0.05),異桿菌與組胺、IL-6的表達呈正相關(P < 0.05),糞球菌與IL-6、TNF-α的表達呈正相關(P < 0.05), Turicibacter與TNF-α的表達呈正相關(P < 0.05)(圖6F)。

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圖6:LP-UJS-EVs對UC小鼠腸道菌群組成的影響


7.LP-UJS-EVs影響UC小鼠糞便代謝組學

為了闡明LP-UJS-EVs對UC小鼠代謝的潛在影響,對小鼠糞便樣本進行了非靶代謝組學檢測,通過對LP-UJS組和DSS組之間以及LP-UJS- ev組和DSS組之間差異代謝物的富集分析,發現通路賴氨酸降解是兩個比較組中最關鍵的共同代謝通路(圖7B,C)。

此外,兩個比較組共有13個共同差異代謝物,其中上調4個,下調9個(P < 0.05, VIP > 1, fold change >2或<0.5)(圖7D)。在兩組的13種共有差異代謝物中,LP-UJS和LP-UJS-EV處理顯著提高了1-棕櫚酰甘油磷膽堿、3-酮鞘醇、氧己酸、香草扁桃酸、n1乙酰亞精胺、3-羥基芐基醇糖苷、12OPDA、25-羥基膽固醇和GMP水平(P < 0.05)。相反,別嘌呤醇、甲氧二烯、二十二碳六烯酸和氯氰菊酯水平明顯下調(P < 0.05)。

腸道微生物菌群與代謝物之間的相關性分析結果顯示,葡萄球菌與n1 -乙酰精胺和氧己二酸呈負相關(P < 0.05)(圖7F)。這些發現強調了葡萄球菌和腸道代謝物(如n -乙酰精胺和氧己二酸)在UC小鼠炎癥發病機制中的重要作用。

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圖7:LP-UJS-EVs對UC小鼠糞便代謝水平的影響

研究結論

最近的研究表明,多種乳桿菌種類分泌的EV可以促進動物模型炎癥性腸病的恢復。植物EVs在體外實驗中可誘導巨噬細胞M2極化22,但在體內是否也能誘導巨噬細胞M2極化尚無文獻報道。在這項研究中。作者全面從體內和體外研究揭示了LP-UJS-EVs在協調巨噬細胞向M2表型極化和調節免疫反應方面的實質性影響。

UC的發展與腸道微生物群多樣性的減少和病原體豐度的增加有著復雜的聯系,本研究,將特定細菌與炎癥標志物聯系起來的相關性分析為腸道生態系統內復雜的相互作用網絡提供了有價值的見解,LP-UJS-EVs選擇性影響益生菌和致病菌豐度的能力為靶向治療干預開辟了道路,并為UC治療提供了個性化的方法。

一些研究證明,腸道菌群在人體賴氨酸代謝中起著重要作用,本研究也驗證了這一結論,并且通過微生物菌群和代謝組相關性分析,發現了差異代謝物n1 -乙酰精胺與葡萄球菌之間呈現顯著負相關,n1 -乙酰精胺在治療結腸炎和增強對癌癥(包括結腸癌)的抵抗力方面具有顯著的治療作用。經LP-UJS-EVs治療后,觀察到n1 -乙酰精胺水平顯著升高,這間接證實了腸道微生物群組成和代謝物的調節是LP-UJS-EVs發揮其治療作用的關鍵途徑。

總體而言,本研究在EV水平上對LP-UJS治療UC的機制有了全面的了解,此外,LP-UJS-EVs與氧己二酸和巨噬細胞極化之間的關聯為進一步探索開辟了道路,并可能為治療腸道炎癥性疾病的創新治療策略提供新的途徑。

原文鏈接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c01758



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