2024-06-17
近日，佛山市婦幼保健院科研實驗室夏承來研究員團隊在一區期刊《Gut Microbes》（IF:12.2）上發表題為“Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation”最新科研成果。通過16S rRNA gene測序，對臨床中乳腺癌和良性乳腺疾病結節患者的腸道菌群譜系的組成和差異進行了分析，并建立小鼠乳腺癌模型，利用非標定量蛋白譜、DNA甲基化、靶向代謝分析等技術，多角度深入探究腸道菌群參與乳腺癌發生和發展的作用機制。本研究發現Prevotella copri在乳腺癌患者的腸道微生物群中顯著富集。P. copri 可促進無特定無病原體小鼠（SPF）和無菌小鼠（GF）的乳腺癌生長，并引起吲哚-3-丙酮酸(IPyA)的急劇降低。過量的P. copri 消耗了大量的色氨酸(Trp)，阻礙IPyA在宿主體內的生理積累。IPyA在生理水平上是宿主內在的抗癌物質，通過抑制UHRF1的轉錄水平，減少細胞核中UHRF1和PP2A C，從而促進AMPK的磷酸化，這與P. copri 的促癌作用正好相反。過量的P. copri 耗盡IPyA加強了UHRF1介導的負調控途徑，導致AMPK信號通路失活，最終促進腫瘤生長。本研究結果首次強調了P. copri 是乳腺癌發生和發展進程中的一個危險因素，為后續的機制探索和臨床研究提供了新的思路！
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一.研究背景
全球女性因為乳腺癌而死亡的人數逐年上升，并且趨向年輕化，乳腺癌逐步成為女性癌癥死亡的“冷酷殺手”，其發展趨勢越來越令人擔憂。近年來，大量的研究表明腸道微生物在癌癥發生和發展中發揮著非常重要的作用，腸道微生物組對宿主存在多種影響，例如在乳腺癌中，存在于乳腺組織和腸道中的微生物具有相似的組成和功能。盡管已經報道了乳腺癌患者腸道微生物的組成和功能特征，但腸道微生物與乳腺癌之間的詳細因果關系仍不明確。本研究對臨床中乳腺癌和良性乳腺疾病患者的腸道菌群譜系的組成進行了差異分析，并建立小鼠乳腺癌模型，利用非標定量蛋白譜、DNA甲基化、靶向代謝分析等技術，多角度探索P. copri 在促進乳腺癌發展過程中的因果關系和機制。
二.實驗設計
1.實驗目的：以臨床中乳腺癌和良性乳腺疾病患者的腸道微生物作為研究對象，通過高通量測序手段檢測腸道微生物組成，并建立小鼠乳腺癌模型，利用非標定量蛋白譜、DNA甲基化譜、靶向代謝分析等技術，探究Prevotella copri 對乳腺癌影響及其因果關系和機制。
2.分組設計：
a)臨床研究設計：共2個分組，共取樣42例乳腺癌(CA)患者和40例良性乳腺疾病(NC)患者的糞便樣本。
b)小鼠乳腺癌模型：共4個分組，分別為SPF-Ctrl/SPF-P組，GF-Ctrl/GF-P組，P組為口服Prevotella copri ；在第8天時，將4T1細胞或EMT6細胞接種于小鼠右側第四乳脂墊皮下。
c)IPyA實驗：當腫瘤體積達到約30mm3時，再分為SPF-Ctrl組和SPF-IPyA組。SPF-IPyA組為對小鼠進行灌胃IPyA溶液 3周。
3.測序平臺：Illumina MiSeq PE250
4.測序區域：細菌16s V3-V4區（338F/806R）
5.其他分析：熒光原位雜交（FISH）/四維非標定量蛋白質譜/DNA甲基化譜/靶向代謝組學等技術。
三.研究結果
1.P. copri增加與乳腺癌的發生發展密切相關
通過研究發現，乳腺癌（CA）患者組的腸道微生物α多樣性顯著低于良性乳腺疾病(NC)患者組。主坐標分析(PCoA)表明CA組的β多樣性與NC組差異顯著。LEfSe分析發現CA組的Bifidobacterium, Collinsella, Faecalibacterium, Ruminococcus, 和Selenomonas的相對豐度顯著降低，而Succinispira 和Prevotella 的相對豐度顯著升高。此外，在所有參與者中，P. copri 是Prevotella 的優勢種，而且P. copri 在CA組的腸道微生物中更加豐富。這些發現表明，Prevotella的增加，特別是P. copri，與乳腺癌的發生密切相關。
Fig.1：乳腺癌患者的腸道微生物群特征
2.P. copri促進4T1小鼠模型中乳腺癌生長
采用4T1小鼠乳腺癌模型，探討P. copri 在乳腺癌發生發展中的作用。在接種4T1細胞前，對SPF-P組和GF-P組口服P. copri ，結果發現，口服P. copri 的GF小鼠(GF-P)的4T1腫瘤生長速度明顯高于GF-Ctrl。SPF-P和GF-P組的腫瘤顯著重于其對應組。此外，SPF-P組糞便中P. copri 的相對豐度顯著高于SPF-Ctrl組。在GF小鼠中，GF-P組糞便微生物以P. copri 為主。熒光原位雜交證實了P. copri 在GF-P組腸道中的定植。這些結果表明P. copri的富集在乳腺癌的發展中起著關鍵作用。
Fig.2: P. copri 可促進SPF和GF小鼠4T1腫瘤的生長
Fig.3：P. copri 在SPF和GF小鼠的腸道中定植
3.在P. copri 影響乳腺癌的過程中，AMP活化蛋白激酶(AMPK)信號通路被PHD和UHRF1調控的DNA甲基化抑制
本研究共發現51個差異表達蛋白質，其中38個顯著上調，13個顯著下調。其中轉錄蛋白UHRF1的上調在表觀遺傳控制中起著關鍵作用。經WB驗證，UHRF1在腫瘤中的表達在GF-P組顯著高于GF-Ctrl組；在SPF-P組有上調的趨勢。此外，DNA甲基化轉移酶3A在SPF-P和GF-P組中增加。RRBS結果顯示，GF-P組的整體甲基化水平與GF-Ctrl組不同。代謝和能量控制的AMPK信號通路是唯一同時富含蛋白質組和DNA甲基組的共同通路，表明AMPK通路在P. copri 的促癌作用中起著重要作用。用P. copri 處理后，AMPK的磷酸化明顯受到抑制。綜上所述，蛋白質組和DNA甲基組都表明，UHRF1調控的DNA甲基化致使代謝和能量控制的AMPK信號通路失活，這在P. copri 促進癌癥的過程中起著重要的作用。
Fig.4：P. copri 調控4T1腫瘤蛋白譜
Fig.5：P. copri 改變了4T1腫瘤的DNA甲基化譜
4.P. copri 會耗盡宿主體內抑制腫瘤生長的吲哚-3-丙酮酸(IPyA)
利用超高效液相色譜-串聯質譜儀(UPLC-MS/MS)對血清中約200種代謝物進行了定量化。結果表明，P. copri 處理組中各種代謝物的相對豐度與非處理組有顯著差異。在SPF-Ctrl組和SPF-P組之間的比較中，46種差異代謝產物被確定為潛在的生物標志物，而在GF-Ctrl組和GF-P組之間的比較中，有39種潛在的生物標志物。此外，SPF-P組和GFP組的富馬酸、氧戊二酸、氧己二酸和吲哚-3-丙酮酸(IPyA)含量均顯著低于其對應組。P. copri 處理顯著降低了IPyA和色氨酸(Trp)含量。進一步驗證表明，P. copri 可以消耗Trp，口服P. copri 促進腫瘤生長的同時伴隨著IPyA的急劇減少，推測IPyA可能是宿主體內的一種固有的細胞毒性代謝物。體外實驗結果表明，IPyA對乳腺癌細胞增殖和集落形成均有抑制作用。IPyA還顯著抑制正常結腸上皮細胞和宮頸癌細胞增殖。綜上所述，P. copri 促進腫瘤生長主要依賴于從Trp中耗盡IPyA。
Fig.6：P. copri 調節宿主的代謝物，耗盡內在的抗癌IPyA
Fig.7 IPyA對4T1細胞具有細胞毒性
5.IPyA通過抑制UHRF1介導的負調控激活AMPK抑制細胞增殖
最后本文探討了IPyA對4T1細胞的細胞毒作用機制。結果表明，當表現出細胞毒性時，IPyA下調UHRF1、DMMT3A和DNMT1的表達，促進AMPK磷酸化，同時上調總mTOR和ULK1的表達。此外，IPyA增加了CFTR啟動子甲基化，這些結果與P. copri 對腫瘤蛋白質譜和DNA甲基化變化的影響正好相反，表明IPyA耗竭在P. copri 促進腫瘤發展過程中起關鍵作用。本研究發現IPyA抑制了細胞核內UHRF1和PP2A C的表達，隨后增加了AMPK的磷酸化，且IPyA抑制了UHRF1的轉錄，這與抑制UHRF1蛋白的表達一致，表明轉染UHRF1報告基因的4T1細胞的熒光素酶活性降低。根據OCR和ECAR的結果，可以計算出由線粒體氧化磷酸化(mitoATP)和糖酵解(glyATP)產生的ATP大幅減少，導致總ATP的產生明顯減少。在IPyA處理下，mitoATP在總ATP生成中所占的比例顯著降低，而glyATP所占的比例更高，這是AMPK活化的典型結果。
為了進一步證實P. copri 對乳腺癌進展的促進作用，本文還研究了P. copri 在另一種小鼠乳腺癌細胞株EMT6誘導的乳腺癌模型中的作用，以及IPyA對該細胞的影響。正如預期的那樣，口服P. copri 使EMT6腫瘤生長更快，并且P. copri 組的小鼠腫瘤重量顯著高于未處理組。與在4T1細胞中的發現結果類似，在P. copri 處理的小鼠中，UHRF1上調，而AMPK的磷酸化受到抑制。IPyA抑制EMT6細胞的增殖和集落形成，下調UHRF1的表達，但促進AMPK的磷酸化。
綜上所述，IPyA通過抑制UHRF1介導的負調控激活AMPK，重新編程細胞能量穩態，最終抑制細胞增殖，IPyA的顯著減少對于P. copri 促進乳腺癌具有根本的重要意義。
Fig.8 IPyA通過抑制UHRF1介導的負調控來激活AMPK
Fig.9 P. corpi 促進EMT6腫瘤生長，而IPyA對4T1細胞具有細胞毒性
四.研究結論
P. copri 是乳腺癌患者腸道微生物中的一種顯著富集和普遍存在的細菌，可能成為乳腺癌進展的一個新的風險因素。通過多組學和大量驗證實驗表明，過量的P. copri 消耗了大量的Trp，從而阻礙了IPyA在宿主中的生理積累。IPyA在生理水平上是宿主體內的一種內源性抗癌物質，IPyA可以直接抑制UHRF1的轉錄，進而減少細胞核內UHRF1和PP2A C，從而促進AMPK的磷酸化，這與P. copri 的促癌作用正好相反。因此，過量的P. copri 對IPyA的耗竭加強了UHRF1介導的負調控作用，使能量控制的AMPK信號通路失活，從而促進腫瘤生長。本研究結果首次強調了P. copri 是乳腺癌發生和發展進程中的一個危險因素，為后續的機制探索和臨床研究提供了新的思路！
原文引用：Jiyan Su, Xiaojie Lin, Dan Li et al. Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation. Gut Microbes 16.1 (2024): 2347757.
DOI：10.1080/19490976.2024.2347757
