2024-06-07
近日，上海交通大學在醫學領域的《Marine drugs》發表新研究成果！本研究從南極深海中分離得到的海綿相關細菌Streptomyces sp. DSS69基因組結果中挖掘了一個可能負責大環內酰胺生物合成的隱性基因簇，整個生物合成基因簇的克隆與異源表達促成了weddelamycin的發現，并且闡明了涉及weddelamycin產生的一個負向調節因子WdlO及兩個正向調節因子WdlA和WdlB。本研究不僅為開發新的抗感染藥物提供了一種新的聚烯內酰胺同系物，而且還為未來的組合生物合成奠定了基礎，以提高PMLs和其他相關天然產物為基礎的藥物先導物的可用性。 本研究的細菌基因組完成圖測序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
1、研究背景 多烯大環內酰胺（PMLs）是一類由16-34個環狀內酰胺環構成的天然產物，該環上帶有兩個獨立或分離的多烯片段，這些片段常經歷分子內環化反應形成復雜的多環結構。由于結構多樣性，PMLs展現出廣泛的生物活性，包括抗病毒、抗菌、抗真菌及抗腫瘤作用。陸地和海洋環境中的放線菌，特別是鏈霉菌，是自然PMLs的主要生產者。另外，生物信息學分析揭示了大量潛在PMLs的隱性生物合成基因簇分布廣泛。實際上，基因組挖掘技術已成功用于新PMLs的鑒定。鑒于許多細菌菌株遺傳操作的難度，挑選特定基因簇進行異源表達已成為激活沉默基因簇、挖掘新天然產物基因組及表征生物合成途徑的有效策略。
2、研究材料與方法 1、實驗材料：南極深海中分離得到的海綿相關細菌Streptomyces sp. DSS69 2、測序平臺：PacBio+Illumina 3、分析內容：細菌基因組完成圖測序、16S序列比對、次級代謝產物基因簇分析。
3、研究結果 基因組測序和產次級代謝產物能力鑒定 Streptomyces sp. DSS69全基因組測序結果顯示，其基因組大小為7.7Mb，GC含量為71.7%，染色體為線性結構。16S rDNA比對表明，DSS69菌株與S.microflavus NA06532和S.fulvorobeus DSM 41455親緣關系最近。antiSMASH分析發現DSS69菌株基因組中含有36個假定的次生代謝產物BGCs，共有1.36 Mb，占全基因組的17.7%。這些BGCs負責四種聚酮、八種非核糖體肽、三種雜交PK-NRPs、六種核糖體合成和翻譯后修飾肽和其他十五種肽的生物合成。BGC15是DSS69菌株的是一種假定的I型聚酮合成酶(PKS) BGC。它在基因組成和基因排列上顯示了與幾種多烯大環內酯類抗生素生物合成基因簇的高度相似性，這意味著它們可能共享類似的生物合成途徑和機制。然而，進行了大量的嘗試，但未能從DSS69菌株的發酵培養物中鑒定出bombyxamycin或piceamycin，wdl BGC可能在DSS69菌株中處于靜默狀態，或者編碼的是一種未知的化合物。這一結果進一步強調了通過異源表達該基因簇來發現新化合物的重要性，并提示DSS69菌株中可能存在獨特的代謝潛力等待揭示。 圖1 DSS69菌株基因組圈圖和wdl BGC基因簇的比較圖 weddellamycin的分離與鑒定 本研究構建了一個包含目標基因簇的BAC文庫，旨在將原本在DSS69菌株中可能未表達或低表達的wdl BGC轉移到一個更適宜的宿主中進行高效表達。通過PCR實驗，篩選并獲得了一個包含完整wdl BGC的BAC克隆，命名為pBAC-wdl，將此克隆轉入到S.lividans GX28這一已知能夠有效表達外源基因簇的模型宿主中。高效液相色譜發現在經過異源表達的S.lividans GX28/pBAC-wdl菌株的培養物中出現了一個新的化合物峰，表明異源表達成功激活了目標基因簇并產生了新的代謝產物。隨后，從10L規模的發酵培養物中分離純化了這個新化合物，即weddellamycin(1)，并對其進行了詳細的化學結構和生物活性特征分析。 圖2 S. lividans GX28/pBAC-wdl中weddellamycin(1)的鑒定 化合物1為黃色粉末，經過一系列鑒定后將其命名為weddellamycin。weddellamycin(1)的結構與piceamycin相似，除了一個新出現的六元二氫吡喃-4- 1環與piceamycin的2-環戊酮環融合，這導致其形成了一個不尋常的三環骨架。因此，化合物1是一個獨特的23/5/6-三環聚烯內酰胺。 weddellamycin生物合成途徑 wdl BGC與piceamycin/bombyxamycin BGC之間的基因-基因高度相似表明，weddellamycin的產生途徑除了最后的環化步驟外，其生物合成途徑類似于piceamycin和bombyxamycin。 圖3 提出的weddellamycin (1)生物合成途徑 提高weddellamycin的產量研究 由于化合物1與其他PLMs一樣不是很穩定，并且其在異源表達宿主中的產量很低，很難積累足夠的純底物進行生物活性試驗，故轉向wdl BGC定位的調控基因來提高產量。wdl基因簇編碼1個LuxR家族調控子(WdlA)、2個TetR家族調控子(WdlB和WdlO)和1個GntR調控子(WdlU)。為了研究這些調節因子在weddellamycin產生中的作用，使用λ RED介導的PCR靶向技術，從pBAC-wdl中分別敲除了wdlA、wdlB、wdlO和wdlU。將得到的4個基因缺失質粒通過偶聯轉移到S. lividans GX28中，得到4個基因缺失突變體。發酵提取物的HPLC分析顯示，WdlA和WdlB在weddellamycin生物合成的調控中起著積極作用，WdlO起著消極作用，WdlU起著不可檢測的作用。 圖4 wdlA、wdlB、wdlO和wdlU基因缺失對weddellamycin生物合成的影響 為了確認wdlA和wdlB的調控作用，并進一步增加weddellamycin的產量，在S. lividans GX28/pBAC-wdl和GX28/pBAC-?wdlO中，通過整合構建子kasOp*控制下，wdlA和/或wdlB過表達。如預期一致，與親本菌株GX28/pBAC-wdl相比，所有過表達突變體的weddellamycin發酵滴度都大幅提高。定量分析顯示，與S. lividans GX28/pBAC-wdl相比，wdlA和wdlB過表達的GX28/?wdlO+OwdlAB中weddellamycin的產量提高最為顯著。 圖5過表達wdlA和/或wdlB對S.lividans GX28/pBAC-wdl和GX28/pBAC-?wdlO中weddellamycin生成的影響 生物活性 測定了weddellamycin對7種革蘭氏陽性菌、1種真菌菌株和1種革蘭氏陰性菌的抑菌活性，結果發現weddellamycin對所有革蘭氏陽性細菌和真菌菌株都有較強的抑制活性，而weddellamycin對革蘭氏陰性桿菌大腸桿菌無有效活性。 表1 化合物1的抑菌活性 測定weddellamycin對人白血病HL-60、人肝癌HepG2、人膠質母細胞瘤U-87MG、人結腸癌HCT 116的體外細胞毒性。結果表明，化合物1對這些細胞系具有較強的細胞毒性，IC50值在2.07 ~ 11.50μM之間。 表2 化合物1的細胞毒性活性
4、結 論 本研究對南極深海海綿樣本中分離得到的Streptomyces sp. DSS69進行全基因組測序，通過基因組挖掘鑒定出一個隱型多烯內酰胺生物合成基因簇wdl。結合BAC文庫和異源表達的策略成功激活wdl BGC，從而鑒定出一種新的PML，名為weddellamycin（1），它含有獨特的23/5/6-三環大內酰胺支架。本研究提出了化合物1的生物合成途徑，并發現三個位于基因簇的調節基因（wdlA、wdlB和wdlO）能夠調節weddellamycin（1）的產量。此外，weddellamycin（1）被證實對真菌病原體以及革蘭氏陽性細菌，具有活性。
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文章索引：Chen, Lu, et al. The Discovery of Weddellamycin, a Tricyclic Polyene Macrolactam Antibiotic from an Antarctic Deep-Sea-Derived Streptomyces sp. DSS69, by Heterologous Expression. Marine Drugs 22.4 (2024): 189.
