2024-06-03
廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所在國際著名雜志《Environmental Science & Technology》發(fā)表了電子穿梭體介導(dǎo)的微生物胞外電子傳遞機制進行研究，揭示了脂溶性電子穿梭體可直接滲入細胞膜與周質(zhì)蛋白反應(yīng)完成胞外電子傳遞的新機制。本研究的RNA-seq測序以及部分分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。 一、技術(shù)路線 二、研究背景 電子穿梭體可顯著加速胞外電子傳遞，但此前人們對于電子穿梭途徑的認識并不全面，這項研究中，作者發(fā)現(xiàn)了一種新的電子穿梭途徑，即親脂性電子介體-刃天青（resazurin）介導(dǎo)的EET過程。 三、研究材料與方法 1.實驗材料 對照組：不加刃天青的希瓦氏菌 處理組：加入刃天青的希瓦氏菌 2.測序平臺 Illumina novaseq6000 3.分析方法 RNA-Seq、BES、SEM、In-situ FTIRs等 四、研究結(jié)果 1.驗證刃天青可在細菌中穿過磷脂雙層膜 在刃天青的作用下，編碼外膜細胞色素的基因被下調(diào)。雖然細胞色素缺失顯著降低了生物電流的產(chǎn)生量，僅為野生型的1-12%，但是在刃天青的處理下突變體菌株（ΔmtrA/omCA/mtrC）的生物電流產(chǎn)生量恢復(fù)到168 μA·cm-2，幾乎相當(dāng)于WT（194 μA·cm-2）的水平，這表明刃天青介導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移不依賴于Mtr途徑。 圖1. 脂溶性電子穿梭體可直接滲入細胞膜 2.WT MR-1菌株轉(zhuǎn)錄組測序分析 為了進一步闡明電子轉(zhuǎn)移基因是如何與刃天青相互作用的，進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明，在含有刃天青的處理中，共篩選了362個差異基因，其中mtrCAB和omCA等外膜細胞色素C的表達量全部顯著下調(diào)，意味著微生物對外膜Mtr蛋白的依賴降低；而如果將外膜細胞色素C敲除，突變株ΔmtrA/omCA/mtrC在刃天青的介導(dǎo)下仍然能產(chǎn)生與野生型強度相似的電流，進一步證明了刃天青可替代外膜細胞色素C的作用。 圖2 轉(zhuǎn)錄組分析火山圖 圖3 GO富集分析氣泡圖 圖4 刃天青介導(dǎo)的生物膜形成相關(guān)的差異表達基因 3.驗證無膜外細胞色素的高效EET Mtr通路被認為是S.oneidensis MR-1中EET的重要組成部分，然而在細胞色素缺失突變體的MR-1中，最大電流約是WT細胞的一半，此外刃天青可以完全恢復(fù)MR-1的EET能力，即使在關(guān)鍵的電子轉(zhuǎn)移基因缺失后也是如此。實驗結(jié)果表明，無論關(guān)鍵的外膜電子轉(zhuǎn)移基因(MTRA、OMCA和mtrC)是否被敲除，刃天青都能顯著促進MR-1的細胞生長. 圖5 有無50μM刃天青的生物電化學(xué)檢測 4.驗證刃天青與胞外/膜內(nèi)細胞色素的相互作用 刃天青恢復(fù)了外膜細胞色素缺失突變體的電子傳遞能力，但CymA基因的缺失幾乎完全抑制了細胞的生長，為了進一步了解刃天青是否通過與CymA直接接觸而介導(dǎo)電子傳遞，進而研究了突變體ΔmtrA/omcA/mtrC/fccA/cctA的電流產(chǎn)生和生物膜生長。結(jié)果表明，在沒有FccA和 CctA的情況下，CymA可以直接將電子轉(zhuǎn)移到刃天青，但直接電子轉(zhuǎn)移速率很低，并且支持非常緩慢的細胞生長。根據(jù)基因敲除結(jié)果，刃天青的存在導(dǎo)致厭氧呼吸基因的下調(diào)，但電子傳遞保持不變，而cym, fccA和cctA這三個基因在刃天青介導(dǎo)的EET中起著關(guān)鍵作用。 圖6 突變株電流密度、掃描電鏡圖像和生物膜總蛋白質(zhì)含量 圖7 S. oneidensis生物膜的電化學(xué)特性 五、小 結(jié) 本研究證實了低分子量、親脂性強的電子受體，具有與周質(zhì)蛋白和細胞內(nèi)膜蛋白直接反應(yīng)介導(dǎo)胞外電子傳遞的能力。由于自然界中大多數(shù)微生物不具有外膜細胞色素C，滲入型電子穿梭的方式可能具有廣泛性，本實驗為了解自然界電子穿梭體的作用方式以及穿梭體的工程化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
原文鏈接：https://pubs.aCs.org/doi/abs/10.1021/aCs.est.2C07862
