2024-05-27
老壇酸菜是一種受歡迎的中國傳統發酵蔬菜，在工業上經過４次發酵生產。然而，４個生產發酵階段的老壇酸菜風味品質差異及其原因尚不清楚。近日，南昌大學食品學院熊濤教授團隊在《Food Chemistry》上發表了新的研究成果，確定了老壇酸菜風味形成的核心微生物和不同發酵周期的差異特征風味化合物以及微生物演替的驅動因素，揭示了關鍵風味化合物的代謝途徑，以及與核心微生物的關系，為研究老壇酸菜發酵過程中風味品質的提升提供了一個新的視角。
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研究背景 作為一種傳統發酵蔬菜，老壇酸菜因其風味獨特而廣受消費者歡迎，目前的研究大多集中在單輪實驗室規模的發酵蔬菜中微生物群落和風味屬性之間的相關性上，很少有研究關注工業規模發酵蔬菜多輪發酵過程中微生物的演替和風味品質的差異。此外，對蔬菜發酵過程中微生物群落聚集過程的研究也較少。因此，本研究對工業規模(500 kg/批)老壇酸菜4輪發酵的風味品質和菌群進行了研究，旨在確定影響風味形成的核心微生物群、化合物，及其相互作用機制，進一步重點篩選具有優良風味調節能力的發酵菌株來提高老壇酸菜的風味品質。
實驗設計 將新鮮腌雪里蕻加鹽水和各種輔料室溫（約20℃-25℃）發酵一個月作為第一次發酵；取第一次發酵物加入老鹽水（鹽度6%-8%）放入壇子進行第二次發酵，重復第二次發酵的步驟兩次，作為第3次和第4次發酵。每一次發酵結束后，選擇5個特定罐，從每個罐的上、中、底層采集樣品，充分混合作為代表樣品（n=5）。
研究結果 1. 老壇酸菜發酵4次發酵過程中發酵參數的動態變化 對老壇酸菜不同發酵周期樣品的發酵參數進行檢測，發現不同發酵周期之間存在顯著差異（圖1A-D）。pH在第1 ~ 3次發酵時顯著升高，在第4次發酵時顯著降低；老壇酸菜的可滴定酸度（TA）隨著發酵次數的增加而顯著升高；鹽分在第1次發酵樣品中含量最高，然后隨著發酵次數的增加而顯著下降；亞硝酸鹽含量從第1次到第2次發酵過程中顯著增加，從第2次到第4次發酵時顯著降低，且在第2次發酵時達到峰值（4.57 mg/kg），值得注意的是老壇酸菜在各次發酵樣品中的亞硝酸鹽濃度均低于國家限量標準（20 mg/kg）。 圖1 老壇酸菜四次發酵過程中發酵參數和有機酸的動態變化 ２. 老壇酸菜發酵4次發酵樣品的口感差異 在4次老壇酸菜發酵過程中，共檢出4種有機酸和１７種游離氨基酸，且具有顯著差異，其中草酸、乳酸和乙酸含量隨著發酵次數的增加而逐漸積累，而蘋果酸含量呈先上升后下降的趨勢，且在第3次發酵時達到峰值（圖1G-H）。總氨基酸、鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸含量均隨發酵次數的增加而增加。在不同發酵周期中，賴氨酸（Lys）含量最高，是除第1輪發酵外各發酵輪中唯一具有風味活性的氨基酸，且其含量隨著發酵次數的增加而不斷增加。綜上，不同發酵周期的老壇酸菜口感品質的差異主要歸因于草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸和賴氨酸含量的變化。 表1老壇酸菜在四次發酵過程中17種游離氨基酸的動態變化及其味覺活力值分析 ３、老壇酸菜4次發酵過程中香氣的變化 采用GC-QTOF/MS聯用技術對不同發酵次數老壇酸菜的揮發性代謝產物進行了分析，共檢出76種揮發性化合物，包括22種萜類化合物、13種硫化物、11種烴類化合物、9種酯類化合物、6種氮化物、5種醇類化合物、4種異硫氰酸酯類化合物、3種酮類化合物和3種其他化合物。此外，第3次發酵樣品中萜類化合物的含量低于其他發酵輪，而異硫氰酸酯的濃度則相反。各次發酵樣品中所有揮發性風味代謝物的主成分分析（PCA分析）和HCA得分圖以及偏最小二乘法分析（PLS-DA）結果表明第2輪和第3輪的風味譜更為相似。此外，共有31種代謝物（VIP>1，p<0.05）被鑒定為香氣差異化合物，且這些差異化合物在不同發酵階分布不同，它們在第2、3次發酵樣品中分布更相似。其中，萜類化合物主要是在第1次和第4次發酵中富集。上述結果表明，31種揮發性風味物質含量的差異導致不同發酵周期老壇酸菜香氣品質的差異。 圖2 老壇酸菜4次發酵過程中香氣的變化 ４、老壇酸菜形成過程中微生物群落的演替 對不同發酵周期的老壇酸菜樣品微生物多樣性進行研究，發現發酵周期不同，其微生物群落結構也不同。第1次發酵樣品的物種豐富度和均勻度均顯著高于第4次發酵樣品，且隨發酵次數的增加而逐漸降低。在門的水平上，4次發酵樣品中的優勢菌均為厚壁菌門微生物，但在屬水平和種水平上，各發酵樣品中的優勢菌各不相同，其含量變化趨勢也不一致。Lefse分析結果發現，不同發酵周期樣品具有不同的差異標志物。 圖3 老壇酸菜在4次發酵過程中微生物群落的演替 ５、老壇酸菜4次發酵樣品中的微生物群落組合和共現模式 對老壇酸菜4次發酵過程中影響微生物群落聚集的關鍵非生物因素進行方差分解分析（VPA分析），發現有機酸（草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸）和發酵參數(pH、TA、鹽分和亞硝酸鹽)與微生物群落結構顯著相關，其中有機酸是影響微生物群落組合的主要驅動力。通過構建4次發酵過程中的微生物共生網絡，發現各次發酵樣品的優勢菌群通常屬于同一模塊：第2、3次發酵樣品的優勢菌群主要屬于模塊1，第1次發酵樣品的優勢菌群主要屬于模塊2，而第4次發酵樣品的優勢菌群主要屬于模塊3。對４次發酵樣品中的微生物關鍵種進行Zi-Pi分析，共篩選得到４個connectors和１個module hub。 圖4 老壇酸菜4次發酵樣品中的微生物群落組合和共現模式 ６、不同風味形成的核心微生物和潛在代謝網絡 對老壇酸菜４次發酵樣品發微生物種群與其風味特征進行Spearman相關分析，發現18株細菌與35種風味代謝物相關，其中乳桿菌屬、那慕爾促生乳桿菌、耐酸乳桿菌、植物乳植物桿菌、消化伴生乳桿菌、發酵粘液乳桿菌和棒狀腐敗乳桿菌為差異風味形成的核心微生物。此外，基于KEGG數據庫，通過PICuRST2的功能預測，重構了差異特征風味化合物的潛在代謝途徑，結果表明賴氨酸和L-亮氨酸主要由原料中的蛋白質水解產生。 圖5 關鍵風味形成的核心微生物和潛在的代謝網絡
研究結論 對老壇酸菜4種發酵樣品中風味代謝產物和微生物菌群的動態變化進行研究，獲得以下研究結論： （１）老壇酸菜樣品中有機酸的含量隨著發酵次數的增加而不斷積累，引起老壇酸菜酸味過酸； （２）31種揮發性風味物質的含量在各次發酵樣品具有一定的差異，其中第2次和第3次發酵樣品的香氣成分接近； （３）老壇酸菜在發酵過程中為區別風味形成的核心微生物有乳桿菌屬、那慕爾促生乳桿菌、耐酸乳桿菌、植物乳植物桿菌、消化伴生乳桿菌、發酵粘液乳桿菌和棒狀腐敗乳桿菌。
原文引用： Xiong S, Xu X, Du T, et al. Organic acids drove the microbiota succession and consequently altered the flavor quality of Laotan Suancai across fermentation rounds: Insights from the microbiome and metabolome. Food Chemistry. 2024 450:139335. DOI: 10.1016/j.foodchem.2024.139335.
原文鏈接： DOI: 10.1016/j.foodchem.2024.139335.
