2024-05-20
文章題目：Breaking Iron Homeostasis: Iron Capturing Nanocomposites for Combating Bacterial Biofilm
技術(shù)手段：RNA-seq等
吉林大學(xué)研究小組開發(fā)了一種新的抗菌策略，通過納米復(fù)合材料靶向細(xì)菌鐵攝入并使其饑餓。為細(xì)菌感染的治療提供了一種全面的解決方案。研究結(jié)果發(fā)表在《Angewandte Chemie International Edition》上。本研究中轉(zhuǎn)錄組測序及部分分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
名詞解釋 INIT：鐵營養(yǎng)免疫療法 Ga-CT：Ga/Cu-TCPP，鎵，銅摻雜四（4-羧基苯基）卟啉金屬 MOF:金屬有機(jī)框架 PAMAM PDs：多胺-胺聚合物點(diǎn) NCs/NSs：納米復(fù)合材料/納米片 PDT：光動力療法 PTT：光熱治療法 DFT：密度泛函理論 DEG：差異表達(dá)基因 OMR：外膜受體 PBP：周質(zhì)結(jié)合蛋白 ATP：三磷酸腺苷
研究背景 細(xì)菌感染是當(dāng)前最具挑戰(zhàn)性的問題之一，也是臨床感染性死亡的主要原因。細(xì)菌感染后，宿主會限制鐵離子，導(dǎo)致一種被稱為營養(yǎng)免疫的現(xiàn)象。在與宿主共同進(jìn)化后，細(xì)菌發(fā)展出了適應(yīng)途徑，如氯化血紅素攝取系統(tǒng)，以避免缺鐵。鐵競爭發(fā)生在感染的所有階段，長期控制快速生長的細(xì)菌對宿主來說是具有挑戰(zhàn)性的。因此，開發(fā)一種新的策略來應(yīng)對鐵捕獲細(xì)菌的進(jìn)化對抗菌營養(yǎng)免疫治療至關(guān)重要。 受此啟發(fā)，本文提出了一種鐵營養(yǎng)性免疫療法（INIT）的新策略，利用鎵（Ga），銅（Cu）摻雜四（4-羧基苯基）卟啉（TCPP）金屬有機(jī)框架（MOFs）和多胺-胺聚合物點(diǎn)（PAMAM PDs）構(gòu)建的Ga-CT@P納米復(fù)合材料（NCs）來靶向細(xì)菌鐵攝入并使其饑餓。最終促進(jìn)生物膜根除和組織修復(fù)。本研究從營養(yǎng)學(xué)角度提出了一種創(chuàng)新的抗菌策略，為難治性細(xì)菌感染的治療及其未來的臨床應(yīng)用提供了啟示。
技術(shù)路線
研究內(nèi)容 1、Ga-CT和Ga-CT@P的合成與表征 采用溶劑熱法成功地制備了超薄Ga-CT@P NCs（圖1a）。其中Ga-CT NSs表現(xiàn)出典型的二維形態(tài)，PAMAM PDs分布在2D Ga-CT NSs上。雖然 Ga3+和Cu2+同時被引入到結(jié)構(gòu)中，但分析表明它們在結(jié)構(gòu)中占有不同的位置。具體來說，Cu2+組裝成二維MOF結(jié)構(gòu)，作為連接體，而Ga3+整合到卟啉環(huán)中，形成Ga-CT NCs。因此，利用簡單的材料及其有效的組合來實(shí)現(xiàn)了載流子的形成和有效的離子負(fù)載。 圖1 CT、Ga-CT和Ga-CT@P NCs的表征 2、體外光熱、光動力學(xué)和發(fā)光活性 Ga-CT@P NCs的PDT、PTT和發(fā)光活性如圖2a所示。在光照射下，通過分子熱運(yùn)動證明了Ga-CT@P中Ga3+的有效釋放。帶正電的PAMAM PDs可以賦予Ga-CT@P與帶負(fù)電的細(xì)菌進(jìn)行靜電相互作用的能力，為Ga-CT@P靠近細(xì)菌提供動力。Ga-CT@P具有協(xié)同PDT/PTT和短期抗菌作用。對于剩余的難降解細(xì)菌，卟啉環(huán)將Ga3+提供到細(xì)菌表面，并從細(xì)菌附近去除Fe3+，導(dǎo)致長期的鐵饑餓和死亡。 圖2 光熱、光動力和Fe3+傳感效應(yīng)的評價 3、體外抗菌活性測定 用500μgmL-1的NCs處理大腸桿菌（ATCC 47076）和金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）的生物膜，然后用激光照射（L）進(jìn)一步處理。圖3a顯示與對照組相比，所有實(shí)驗(yàn)組在照射下的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落數(shù)顯著減少。含有PAMAM PDs的Ga-CT@P+L組對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗生素膜作用，與對照組相比減少了約3倍?；铙w染色和掃描電鏡和SEM圖像顯示Ga-CT@P+L組中的細(xì)菌最少。 圖3 Ga-CT@P NCs的抗生膜特性 4、Ga3+-腸桿菌素的密度泛函理論計算 當(dāng)面臨缺鐵困境時，大腸桿菌進(jìn)化分泌腸桿菌素。利用DFT計算研究Ga3+和Fe3+之間的鐵載體結(jié)合競爭（圖4）。腸桿菌素與Ga3+形成的配位鍵長度更均勻，結(jié)合能更大。此外，Ga3+-腸桿菌素比Fe3+-腸桿菌素更穩(wěn)定。設(shè)計的Ga-CT@P NCs可以通過卟啉環(huán)內(nèi)的Ga3+/Fe3+交換來靶向細(xì)菌鐵營養(yǎng)代謝。在缺鐵條件下，Ga3+與Fe3+競爭大腸桿菌分泌的腸桿菌素表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。 圖4 DFT計算結(jié)果總結(jié) 5、Ga-CT@P通過INIT靶向鐵穩(wěn)態(tài) 采用RNA-seq技術(shù)對Ga-CT@P+L處理過的大腸桿菌的DEGs進(jìn)行分析。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示（圖5b），DEGs在三種途徑中密切富集:TCA循環(huán)、鐵硫簇代謝和TCA循環(huán)。GO富集分析（圖5c和5d）揭示了與菌毛組織相關(guān)的DEGs上調(diào)，特別是與鐵饑餓反應(yīng)有關(guān)的傳感器調(diào)節(jié)蛋白。與鐵硫簇代謝、TCA循環(huán)和ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)的DEGs下調(diào)。KEGG富集分析（圖5e和5f）顯示，與TCA循環(huán)相關(guān)的DEGs下調(diào)，而與糖酵解相關(guān)的DEGs上調(diào)。 許多DEGs與細(xì)菌鐵代謝有關(guān)（圖5）。與鐵攝取（exbB、exbD、tonB和fepA）、運(yùn)輸（feoB和efeO）相關(guān)的基因顯著下調(diào)。相反，與鐵儲存相關(guān)的基因（ftnA、nfuA和fur）顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明，Ga-CT@P鐵阻斷處理后，細(xì)菌生物膜中的鐵利用顯著下調(diào)。Ga-CT@P處理后，DEGs（如pgi、pfk、fba和gapA）顯著上調(diào)，與鐵饑餓時糖酵解的全體性上調(diào)一致。此外，結(jié)果表明乳酸代謝途徑和丙酮酸途徑DEGs分別增加和減少。Ga-CT@P+L組乳酸產(chǎn)量高于對照組，導(dǎo)致細(xì)菌糖代謝紊亂。 Ga-CT@P誘導(dǎo)的INIT的確切機(jī)制如圖5i所示。在革蘭氏陰性菌中，釋放的Ga3+與Fe3+競爭，與無鐵的鐵載體結(jié)合，形成Ga3+-鐵載體復(fù)合物。Ga3+-鐵載體復(fù)合物被OMR、PBP和內(nèi)膜ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白內(nèi)化。TonB系統(tǒng)由TonB, ExbB和ExbD蛋白組成，將細(xì)胞質(zhì)膜的質(zhì)子動力與外膜的質(zhì)子動力偶聯(lián)，為該過程提供所需的能量。TonB跨越細(xì)胞質(zhì)和外膜之間的質(zhì)周空間，并與與Ga3+-鐵載體結(jié)合的OMR相互作用。這種相互作用誘導(dǎo)TonB的構(gòu)象變化，并將其傳遞給細(xì)胞質(zhì)膜定位的ExbB和ExbD蛋白。這種構(gòu)象改變從質(zhì)子動力中釋放能量，從而促進(jìn)了Ga3+-鐵載體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。一旦Ga3+-鐵載體被細(xì)胞吸收，Ga3+-鐵載體就可以作為Fe3+模擬物與需鐵酶結(jié)合。在氧化還原循環(huán)中，Ga3+不能替代Fe3+。因此，用Ga-CT@P NCs處理的細(xì)菌表現(xiàn)出缺鐵狀態(tài)，破壞鐵代謝、鐵硫簇生物合成和TCA循環(huán)。 圖5 Ga-CT@P處理大腸桿菌的RNA序列分析 6、體內(nèi)抗菌活性測定 利用大腸桿菌感染小鼠皮膚傷口模型，探索Ga-CT@P NCs在體內(nèi)的抗菌能力（圖6）。Ga-CT@P+L組連續(xù)使用Ga-CT@P NCs治療后，感染創(chuàng)面迅速修復(fù)，幾乎完全消失。Ga-CT@P+L組炎癥細(xì)胞數(shù)量最少，促炎因子IL-1β表達(dá)降低，抗炎細(xì)胞因子Arg1水平升高?？傮w而言，Ga-CT@P NCs具有強(qiáng)大的抗菌能力，通過協(xié)同PDT/PTT/INIT修復(fù)感染創(chuàng)面，抵抗細(xì)菌侵襲，抑制炎癥反應(yīng)，加速膠原沉積，導(dǎo)致感染耗散和再生恢復(fù)。 圖6 Ga-CT@P NCs在體內(nèi)消除傷口感染 7、Ga-CT@P生物安全試驗(yàn) 利用CCK8測定和主要器官的H&E組織學(xué)分析評估細(xì)胞毒性，結(jié)果表明，Ga-CT@P NCs（500μgmL-1）符合細(xì)胞毒性要求。利用體內(nèi)熒光成像技術(shù)評價Ga-CT@P的代謝，結(jié)果表明Ga-CT@P NCs主要通過肝臟代謝，小部分通過腎臟代謝。這些結(jié)果表明Ga-CT@P NCs具有良好的生物安全性，在臨床治療中具有進(jìn)一步應(yīng)用的前景。
研究結(jié)論 在這項(xiàng)研究中，成功地合成了新的Ga-CT@P NCs用于抗菌感染和生物膜的形成。結(jié)果證實(shí)Ga-CT@P NCs通過協(xié)同光熱/光動力/鐵營養(yǎng)免疫治療成功對抗生物膜感染并靶向細(xì)菌鐵營養(yǎng)代謝。首先，Ga-CT@P NCs利用帶正電的PAMAM PDs在帶負(fù)電荷的表面捕獲細(xì)菌。它們具有顯著的協(xié)同光熱和光動力能力。然后，結(jié)合了Ga3+的卟啉在照射后釋放出Ga3+離子，欺騙細(xì)菌吸收，通過卟啉環(huán)從周圍的細(xì)菌環(huán)境中提取Fe3+離子。這種策略使細(xì)菌處于缺鐵的環(huán)境中，并使它們餓死，這被稱為鐵營養(yǎng)免疫療法。同時，所設(shè)計的Ga-CT@P NCs中的PAMAM PDs可作為監(jiān)測細(xì)菌中動態(tài)鐵限制的監(jiān)測器。進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄組水平研究了其抑菌機(jī)制。INIT策略有助于破壞鐵硫簇代謝、TCA循環(huán)和ATP代謝?？傊?，Ga-CT@P所體現(xiàn)的INIT策略為未來通過破壞細(xì)菌營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)來治療細(xì)菌感染提供了新的視角。 方案：Ga-CT@P NCs的形成(左)和抗菌機(jī)制(右)示意圖
文章鏈接 DOI：https://doi.org/10.1002/anie.202319690
參考文獻(xiàn) Sun, Wenyue, et al. "Breaking Iron Homeostasis: Iron Capturing Nanocomposites for Combating Bacterial Biofilm." Angewandte Chemie International Edition （2024）: e202319690.
