2024-05-20
近日，甘肅農(nóng)業(yè)大學在醫(yī)學領(lǐng)域的《LWT》發(fā)表新研究成果！本研究從牦牛酸奶中分離得到一株植物乳桿菌EL2，通過全基因組測序和益生菌活性測定，分析了該菌株的基因組特征及其與益生菌特性相關(guān)的基因，并鑒定出與胃腸道耐酸和抗氧化特性相關(guān)的基因和途徑。本研究有利于藏區(qū)人的健康，研究結(jié)果不僅對西藏地區(qū)益生菌菌株的保存和遺傳，而且對植物乳桿菌菌株的生產(chǎn)和應用具有重要意義。
本研究的細菌基因組完成圖測序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
1、研究背景 植物乳桿菌具有益生菌特性，包括抗菌、抗氧化、降膽固醇、調(diào)節(jié)穩(wěn)定的腸道微生物群和免疫調(diào)節(jié)，這些特性在促進人體健康方面都發(fā)揮著重要作用。其能夠產(chǎn)生有機酸、過氧化氫、細菌素等物質(zhì)，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌等致病微生物具有抑制作用。由于其高效、無毒、無殘留、無耐藥性，被認為是化學防腐劑和抗生素的有效替代品。本研究從甘南藏族自治州傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中分離到一株植物乳桿菌EL2，其具有良好的益生菌作用。本研究旨在通過全基因組測序的方法，在遺傳水平上分析該菌株的益生菌特性和功能基因。對細菌素的抑菌活性和生物合成機理進行了分析，重點為該菌株作為益生菌的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。 2、研究材料與方法 1.實驗材料：牦牛發(fā)酵乳中分離得到植物乳桿菌EL2 2.測序平臺：Illumina +Pacbio 3.分析內(nèi)容：細菌基因組完成圖測序、16S進化樹構(gòu)建、次級代謝產(chǎn)物基因簇分析。 3、研究結(jié)果 植物乳桿菌EL2鑒定 對EL2進行生理生化分析，揭示了其發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖和其他10種糖的能力。過氧化氫酶、明膠液化和淀粉水解測試結(jié)果均為陰性；MRS固體培養(yǎng)基上的EL2菌落呈白色、圓形，并略有凸起。鏡下革蘭氏染色呈紫色，表明存在革蘭氏陽性桿狀細胞；以及根據(jù)16S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，確定其為Lp. Plantarum。 圖1 菌株EL2物種鑒定以及抑菌能力鑒定 植物乳桿菌EL2抑菌能力 對EL2菌株進行抑菌能力鑒定，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌表現(xiàn)出較強的抑制作用，表明無細胞上清中存在抑菌物質(zhì)。在無細胞上清液中加入蛋白酶，同時排除酸和過氧化氫，抑菌區(qū)消失。這表明上清中的抑菌物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，突出了EL2產(chǎn)生細菌素的能力。 植物乳桿菌EL2益生菌評估 PH評估結(jié)果表明，EL2菌株在pH=2時存活率為76.93±2.23%，pH>2.5時存活率可達98%以上。當膽鹽濃度為0.3%時，EL2菌株的增長率為200.26±1.13%，當膽鹽濃度為0.6%時，EL2菌株的增長率為98.43±2.22%。對胃腸道液體的耐受性評估顯示，3 h后，EL2菌株對胃液的回彈性為84.81±2.57%，對腸液的回彈性為92.49±1.35%。此外，EL2菌株對腸道具有粘附性，自聚集率為91.24±0.4%，對二甲苯的疏水性為7.76±0.33。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了該菌株強大的胃腸道恢復能力，符合益生菌的基本標準。 植物乳桿菌EL2的安全性分析 溶血活性分析發(fā)現(xiàn)指示菌株(金黃色葡萄球菌)在平板中央產(chǎn)生了明顯的溶血區(qū)，而被試菌株EL2在其周圍的菌落沒有出現(xiàn)溶血區(qū)，說明安全性較高。藥敏實驗結(jié)果表示，對EL2菌株的抗生素耐藥性評估顯示，EL2菌株對氯霉素和卡那霉素有一定程度的耐藥，而對其他被測抗生素敏感或中敏感。在培養(yǎng)過程中，EL2菌株利用葡萄糖產(chǎn)生酸，使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。隨著培養(yǎng)的進行，如果顏色沒有變化，則表明EL2菌株對胺的生產(chǎn)沒有潛在的威脅。 圖2 EL2菌株溶血活性評估及基因組圈圖 植物乳桿菌EL2的基因組特征分析 EL2菌株染色體長度為3.3Mb，GC含量為44.48%；預測到3個質(zhì)粒，長度分別為76,909bp、13,687bp、3,,210bp。該基因組共包含3155個開放閱讀框，6個5S rRNA，5個16S rRNA，5個23S rRNA，68個tRN，56個ncRNA。 植物乳桿菌EL2細菌素產(chǎn)生相關(guān)途徑及基因挖掘 利用NR、Pfam和Swiss-Prot，分析了EL2菌株中與細菌素產(chǎn)生和分泌相關(guān)的基因，并通過整合BAGEL4和antiSMASH結(jié)果確定了參與細菌素調(diào)節(jié)的代謝途徑。發(fā)現(xiàn)EL2菌株中細菌素基因簇大小為20.3 kb，包含22個細菌素相關(guān)基因。 圖4 BAGEL4預測細菌素產(chǎn)生途徑 antiSMASH分析還發(fā)現(xiàn)了細菌素產(chǎn)生的四種潛在途徑。兩個結(jié)果表明，在EL2菌株基因組中存在編碼六種細菌素前體肽的基因，這些基因負責產(chǎn)生細菌素前體:PlnA、plnN、PlnEF和PlnJK。此外，與QS相關(guān)的基因，即PlnABCD，通過識別信號分子來調(diào)節(jié)細菌素的產(chǎn)生。參與細菌素免疫的基因，PlnL、R、M和I，主要存在于細胞膜上，賦予產(chǎn)生細菌素的菌株對細菌素的抗性。lnGH、PlnTUVW等基因通過特異性裂解參與前體肽的鑒定和成熟，其確切功能尚不清楚，但與細菌素分泌密切相關(guān)。結(jié)合以往的抑菌實驗結(jié)果可知，EL2可產(chǎn)生2種IIb型菌素PlnEF和PlnJK, 1種IIc型菌素PlnA和1種非殺菌型菌素PlnN，對某些革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌均有抑制作用。此外，在EL2基因組中發(fā)現(xiàn)了負責產(chǎn)生AI-2信號分子的LuxS基因，該基因與菌株的雙組分系統(tǒng)一起在調(diào)節(jié)細菌素的產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用。通過antiSMASH分析，鑒定出兩個潛在的抗菌蛋白及其附屬蛋白，命名為Pln1761和Pln3058。 圖5 antiSMASH預測細菌素的產(chǎn)生途徑 不同菌株產(chǎn)菌素基因簇的比較分析 乳酸菌的細菌素基因簇通常由22-26個基因組成，每個基因都參與細菌素的調(diào)節(jié)、產(chǎn)生、免疫、運輸和一些尚未證實的功能。本研究選取的6株菌株的基因簇及其對應的基因信息，通過比較EL2菌株與植物乳桿菌C11、 WCFS1、 NC8、 Curd、 J51、和8P-A3的細菌素基因簇，發(fā)現(xiàn)EL2菌株與WCSF1和C11菌株的基因簇相似性最高。 圖6 不同植物乳桿菌菌株產(chǎn)菌素基因簇的比較分析 植物乳桿菌EL2各個數(shù)據(jù)庫注釋 EL2預測的編碼基因已在NR、eggNOG、KEGG、GO、Swiss-Prot、Pfam和TCDB等數(shù)據(jù)庫中進行了功能注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EL2具有產(chǎn)生多種細菌素的能力。 圖7 EL2菌株各個數(shù)據(jù)庫注釋 VFDB和CARD分析 利用VFDB預測EL2菌株中毒力因子相關(guān)基因，結(jié)果表明該菌株存在多種毒力因子。利用CARD進行抗生素耐藥分析發(fā)現(xiàn)，在其基因組序列(chr_871)中存在一個耐藥相關(guān)基因vanY，使EL2對萬古霉素和替柯普蘭類抗生素耐藥。相反，利用ResFinder無法預測任何抗性基因，證實了其不可轉(zhuǎn)移性。 4、結(jié) 論 從甘南藏區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中分離得到的植物乳桿菌EL2具有完整的細菌素調(diào)控單位，可產(chǎn)生PlnA、E/F、J/K和N等多種細菌素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有廣譜抑制作用。同時，EL2菌株的基因組特征揭示了益生菌的特性，包括酸和膽鹽耐受性，以及抗氧化性能及其相關(guān)基因。研究結(jié)果表明，藏族長期飲用發(fā)酵牦牛乳含有豐富的益生菌，在促進健康方面發(fā)揮著重要作用，并解決了在EL2菌株綜合基因組特征和益生菌活性方面的知識空白。EL2菌株在甘南藏族地區(qū)的乳制品工業(yè)中是一種有前景的益生菌候選菌，在抗菌肽生產(chǎn)中具有潛在的應用前景。 如需進一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：021-80118168-8617）！
文章索引：Zheng, Xue, et al. "Whole genome sequencing and analysis of probiotic characteristics for Lactiplantibacillus plantarum EL2 isolated from yak yogurt." LWT 198 (2024): 116039.
