2024-04-12
題目：Spatiotemporal transcriptomic changes of human ovarian aging and the regulatory role of FOXP1
中文題目：人卵巢衰老的時空轉錄組學變化及FOXP1的調控作用 期刊：Nature Aging 影響因子：16.6 發表時間：2024.4.9 派森諾提供：單細胞轉錄組、空間轉錄組的建庫測序和分析服務 合作單位：華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 背景簡介 1.卵巢具有生育和激素分泌功能，隨著年齡增加，卵巢功能在大約20-30歲時達到頂峰，30歲后開始下降，然后在50歲左右衰竭。 2.大多數女性會在45至55歲之間絕經，此階段卵巢內卵泡耗竭，血液中雌激素水平下降，可能會導致心血管疾病、骨質疏松、老年癡呆、肥胖癥、腫瘤等疾病的發生，因此卵巢衰老被喻為女性機體衰老的起搏器。 3.高分辨率的單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術可以用來研究細胞異質性，繪制器官衰老圖譜。目前已有一些研究鑒定了人類卵巢組織中包含的細胞類型，以及小鼠和靈長類動物卵巢衰老過程中的細胞變化，但是人類卵巢衰老過程中的細胞類型和轉錄調控變化目前仍然未知。 4.卵巢發育是一個動態的過程，因此了解卵巢空間結構對于卵巢的衰老動力學研究是非常有必要的。空間轉錄組學可以將轉錄本映射到組織切片上，實現基因表達的空間可視化，有助于進一步探索卵巢衰老過程中的空間轉錄變化。 實驗設計 單細胞轉錄組： 來自于9名捐獻者的卵巢樣本，被分為3組，分別是年輕組（Y）、中年組（M）和老年組（O）； 空間轉錄組： 來自于15名捐獻者的卵巢樣本，被分為3組，分別是年輕組（Y）、中年組（M）和老年組（O）； 研究結果 1：人類卵巢組織的單細胞和空間轉錄圖譜 作者對來源于9名患者的卵巢樣本進行解離并進行10x上機，經過質控共獲得92965個細胞。對這些細胞進行降維聚類分群并通過經典的細胞類型marker基因注釋，最終得到8種細胞類型，分別是顆粒細胞（GCs）、卵母細胞、卵泡膜和基質細胞（T&S cells）、內皮細胞（ECs）、平滑肌細胞（SMCs）、單核細胞、NK細胞、T細胞（圖1a-b）。每種細胞類型的marker基因的GO富集分析結果顯示，GCs中主要富集的通路與調節激素水平相關，卵母細胞中的富集通路與卵母細胞分化有關，T&S cells主要富集到了“細胞外基質”和“膽固醇轉移活性”通路，而SMCs顯示出在“肌肉系統過程”和“細胞骨架組織”通路中富集。這也側面驗證了單細胞注釋的準確性（圖1c）。 作者對來源于15名患者的卵巢樣本進行OCT包埋并做空間轉錄組測序。通過單細胞數據和空轉數據的聯合分析，對空轉數據進行了注釋，識別出了位于卵泡中心的卵母細胞（圖1d (i))、卵泡周圍的GCs（圖1d（ii）)、廣泛分布的T&S細胞（圖1d（iii）)和沿血管分布的SMC/內皮細胞（圖1d（iv）/(v)）。而免疫細胞，包括單核細胞、NK細胞和T淋巴細胞，主要分布于卵巢髓質（圖1d（vi）、（vii）、（viii））。 圖1：人類卵巢組織的單細胞和空間轉錄圖譜 2：卵巢衰老轉錄程序中的細胞特異性變化 作者對8種細胞類型中 O/Y、M/Y 和 O/M 組之間進行了差異富集分析，發現上調的差異基因富集到的KEGG通路主要與細胞衰老和細胞衰老相關通路有關，比如FoxO 信號通路, IL-17 信號通路, nuclear factor (NF)-κB 信號通路, NOD-like receptor信號通路等，下調的差異基因富集到的KEGG通路主要與細胞遷移、細胞外基質（ECM）-受體相互作用、雌激素信號通路、細胞外囊泡、氧化磷酸化、血小板活化、肌動蛋白細胞骨架調控和緊密連接有關（圖2a）。因此作者又對不同組的細胞分別進行了細胞衰老評分，發現在衰老過程中，大多數卵巢細胞的衰老信號通路評分增加（圖2b）。空間基因表達數據的通路評分結果也同樣發現，老年卵巢的卵泡、皮質和髓質中細胞衰老和衰老相關分泌表型（SASP）信號通路的富集程度提高（圖2c）。不同年齡的人卵巢脂褐素染色（脂褐素，細胞衰老的標志物）結果也顯示脂褐素在卵巢衰老過程中的積累增加（圖2d）。除此之外，不管是單細胞數據還是空轉數據，衰老標志基因CDKN1A/p21也在老年組的所有卵巢細胞類型中均表達增加（圖2e-f）。多重免疫組化 （IHC）結果顯示，在GCs和T&S細胞中，CDKN1A陽性細胞逐漸增加（圖2g）。對SASPs相關細胞因子進行分析發現在老年卵巢中其整體表達增加（圖2h）。接下來，作者還進一步做了RT-PCR和Western blot去驗證（見補充數據）。總之，這些發現表明，老年人類卵巢中的特定細胞類型可能表現出與細胞衰老相關的獨特特征。 圖2：卵巢衰老轉錄程序中的細胞特異性變化 3：卵母細胞在卵巢衰老過程中的時空變化 作者通過擬時序分析幫助確定了卵母細胞3個不同的亞群（cluster a、b、c），其中年輕組的卵母細胞在三種亞群都有分布，而中年組的卵母細胞主要在a組，老年組的卵母細胞主要在c組（圖3a-b）。軌跡分析顯示，年輕組的卵母細胞處于發育軌跡的起點，而年老組的卵母細胞處于終點狀態，提示在卵母細胞衰老過程中存在基因開關（圖3c）。分析不同cluster在偽時間軌跡上的基因表達動態變化，發現三個階段分別有749、418和575個DEGs。對這些DEGs進行GO富集分析，發現cluster a主要富集在“靶向膜的共翻譯蛋白”、“核轉錄的mRNA分解代謝過程”和“翻譯起始”，cluster b在“含膠原的細胞外基質”、“細胞外基質組織”和“細胞粘附的正調節”中表現出富集，cluster c中則是“細胞凋亡”、“雙鏈斷裂修復”和“細胞器裂變”，表明卵母細胞中的DNA損傷和凋亡（圖3d）。因此作者進一步做了DNA損傷和修復基因的基因集合打分，發現在老年卵母細胞中，DNA損傷評分增加，DNA修復評分降低（圖3e）。 單細胞數據的細胞通訊分析結果顯示，卵母細胞與其他細胞類型之間的相互作用在老年組中顯著增強（圖3f），老年卵母細胞表現出配受體對MDK-LRP的表達升高（圖3g）。隨后作者又進行了空間基因集合評分，發現配受體對MDK-LRP1在卵母細胞和周圍細胞中泛表達，并且在衰老組評分更高（圖3h）。IHC染色結果也驗證了這一點（圖3i）。 圖3：卵母細胞在卵巢衰老過程中的時空變化 4：顆粒細胞在卵巢衰老過程中的時空變化 GCs包裹著卵母細胞并與其相互作用，但GCs在衰老過程中分類和變化目前還不清楚。因此作者進一步將GCs細分為3種亞型（GC亞型1、2和3）（圖4a）。細胞占比統計結果顯示，年輕組GCs以亞型1和2為主，而老年組GCs以亞型3為主（圖4b）。各亞群top 8 marker基因氣泡圖顯示，GCs亞型1表達已知標記基因如AMH、FST、HSD1S7B1、SERPINE2和PRKAR2B，以及之前未報道的基因如DSP和MAGED2（圖4c）。接下來作者還對各亞群的marker基因進行了GO富集分析，具體結果見補充數據。總之，這些發現為深入了解人類卵巢中三個GCs亞群的轉錄特征提供了新見解。 接下來作者進一步檢測了空轉數據中顆粒細胞的分布。值得注意的是，三個不同的GCs亞群在空間分布上具有明顯差異。GCs亞型1位于竇卵泡卵丘，2亞型位于卵泡壁層，3亞型在卵泡中廣泛分布（圖4d）。多重免疫組化 （IHC）結果也驗證了該發現（圖4e）。 隨后作者又進一步用monocle2分析了不同顆粒亞群的細胞動態轉換關系，發現GCs亞型1位于軌跡路徑的起點（圖4f-g）。早期GCs亞型1主要分布于年輕和中年卵巢，而老年樣本中的GCs主要是分布于末端的GCs亞型3（圖4h）。為了研究衰老過程中顆粒細胞衰老通路是否會發生變化，我們計算了細胞衰老評分，發現老年卵巢中所有三種類型的GCs均有增加（圖4i）。相應地，CDKN1A在所有三種GCs亞型中也均表達上調（見補充數據）。免疫染色分析證實，老年卵巢GCs中CDKN1A蛋白水平升高（圖4j）。空間轉錄組的基因集合打分也顯示了老年組的GC表現細胞衰老和SASPs相關通路表達更高，特別是GC亞型1（圖4k-l）。為了進一步驗證，又對接受了輔助生殖治療的21-47歲的志愿者取了GCs，以進一步探索細胞衰老（圖4m）。結果發現，隨著年齡22-47歲的增加，SASP相關基因的表達逐漸增加（LMNA，P = 0.0019；CDKN1A，P = 0.0269；IL-8，P = 0.0172）（圖4m）。這些發現表明，細胞衰老通路是GCs衰老的一個潛在特征，這可能導致衰老過程中的卵巢功能下降。 圖4：顆粒細胞在卵巢衰老過程中的時空變化 5：T&S細胞在卵巢衰老過程中的時空變化 卵巢中T&S細胞占比很多，但T&S 細胞在衰老過程中分類和變化目前還不清楚。因此作者進一步對T&S 細胞進行細分，根據轉錄特征的不同定義了5種亞型（T&S1-5）（圖5a），并展示了不同亞群的top marker基因和marker基因的GO富集結果。以STAR和CYB5A表達為特征的T&S1，表現出豐富的RNA和蛋白質合成過程（圖5b-c），并在卵巢髓質中廣泛分布（圖5d）。T&S2，表達ECM相關基因，如COL1A1和COL3A1，與“細胞外囊泡”和“細胞外基質”通路相關，并位于卵泡周圍（圖5b-d）。T&S3表達肌成纖維細胞標記物ACTA2和TAGLN，在位于血管周圍的超分子纖維通路和細胞骨架蛋白結合通路中富集（圖5b-d）。T&S4，由FBLN1和CXCL2定義，位于外皮層，與“化學反應”和“對刺激反應的調節”通路相關，可能參與卵巢對外部應激的防御（圖5b-d）。亞型5，表現為表達CD74、HLA-DRB1、CCL4和HLA-DRA的炎癥樣成纖維細胞，在 “抗原加工和呈遞”和“細胞對干擾素-γ的反應”等通路中富集，可能參與排卵后修復。空間轉錄組數據也進一步展示了間質細胞不同亞群在空間分布上的異同，并且作者還利用T&S亞型細胞的標記物進行了進一步的實驗驗證（圖5d-e）。 接下來作者通過軌跡分析研究T&S細胞亞型的動態轉換關系，發現T&S細胞的亞型2占據了軌跡路徑的初始階段（圖5f）。此外，我們還分析了不同組之間T&S細胞亞型的軌跡差異。值得注意的是，早期的T&S細胞主要存在于年輕和中年樣本中，而老年樣本中的T&S細胞主要存在于過渡路徑的末端，提示在衰老過程中T&S細胞的類型可能發生變化（圖5g）。 基因集合打分結果顯示在衰老過程中，所有T&S細胞亞群的細胞衰老評分均有所增加（圖5h），同時衰老組中的CDKN1A的表達上調（圖5i）。空轉數據和IHC結果證實CDKN1A升高，特別是位于皮質的4亞型（圖5j，左、右）。空轉數據的進一步分析顯示，HMGA1、PIM1、CAV1等SASP相關細胞因子表達顯著升高（圖5k）。接下來作者又對21-47歲女性卵巢來源的T&S細胞進行了檢測，結果發現，隨著年齡22-47歲的增加，與衰老相關的HMGA1、PIM1、CAV1和NF-κB的表達也逐漸升高，這與scRNA-seq和ST分析一致(圖5l)。這些發現共同表明卵巢衰老過程中T&S細胞存在衰老樣特征。 圖5：T&S細胞在卵巢衰老過程中的時空變化 6：FOXP1是卵巢細胞衰老的核心調控因子 上述分析已經證實細胞衰老是卵巢衰老的潛在因素，特別是在GC和T&S細胞中。作者采用單細胞調控網絡推理和聚類分析來鑒定GC和T&S細胞中的核心轉錄因子（TFs）。結果顯示，FOXP1、SOX4和FOS在兩種細胞類型中表達均降低，可能在卵巢衰老中起關鍵作用（圖6a-b）。因此，作者使用人GC系（COV434）進行了FOXP1、SOX4和FOS的敲低，以研究它們對卵巢衰老的影響（見補充數據）。 人卵巢中FOXP1的表達顯示出與年齡相關的hGCs和pT&S的下降（圖6c）。在老年卵巢中的免疫印跡和IHC檢測結果證實了這種下降（圖6d-e）。接下來作者在COV434和pT&S細胞中沉默FOXP1，發現衰老相關（SA）-β-gal染色增加（圖6f）。此外，FOXP1基因敲低后，與細胞衰老和DNA損傷相關的蛋白表達上調（圖6g）。這些發現表明，與年齡相關的FOXP1的減少和衰老之間可能存在關聯。 圖6：FOXP1是卵巢細胞衰老的核心調控因子 后續驗證結果：在GCs中敲除FOXP1可加速卵巢衰老，喂食槲皮素可以保護中年小鼠的卵巢儲備 作者后續構建了敲除小鼠模型，通過一系列生理生化指標測定發現，在GCs中敲除FOXP1可加速卵巢衰老。用槲皮素治療生殖衰老小鼠發現槲皮素可以保護中年小鼠的卵巢儲備（具體實驗設計和分析結果詳見圖7-8。 圖7：在GC中條件敲除FOXP1可加速小鼠卵巢衰老 圖8：槲皮素治療可保護中年小鼠的卵巢儲備功能 總 結 本研究繪制了人類卵巢衰老的時空單細胞轉錄組圖譜，并確定調節卵巢細胞衰老的關鍵分子FOXP1會呈現增齡性下降。槲皮素誘導的FOXP1的激活，有望成為延緩卵巢衰老的有效治療策略(圖8n)。總之，本研究加深了對人類卵巢衰老過程的理解，為研究潛在的治療干預提供了寶貴的資源。后續可以繼續探索FOXP1作為卵巢衰老診斷和治療潛在靶點的有效性。
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s43587-024-00607-1
