2024-01-31
文章題目：Streptomyces-based whole-cell biosensors for detecting diverse cell envelope targeting antibiotics
技術手段：轉錄組
派森諾生物與上海交通大學攜手合作，在《Biosensors and Bioelectronics》上發表了一篇關于鏈霉菌全細胞生物傳感器，可用于微生物藥物篩選和抗生素檢測。
本研究的轉錄組測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
細胞被膜靶向抗生素是治療各種細菌感染的有效藥物。然而，目前的藥物篩選方法繁瑣，缺乏足夠的特異性和敏感性。細菌全細胞生物傳感器能夠利用細胞內的特異性識別元件感知特定生物分子，具有低成本、易操作、高靈敏度和強特異性等特點，因此適用于微生物活性天然產物的高效篩選。 在這里，利用轉錄組學分析了鏈霉菌M1146在4中不同類型的細胞被膜靶向抗生素（桿菌肽、黃霉素、萬古霉素和多粘菌素E）處理下的基因表達差異，顯示糖肽類抗生素（萬古霉素類）可顯著激活VanS/R雙組分系統。因此，設計了一對基于VanS/R的生物傳感器，對糖肽類抗生素的檢測具有高靈敏度和強特異性。此外，為了擴大生物傳感器的檢測范圍，通過啟動子篩選和表征，構建了可特異性檢測細胞被膜靶向抗生素的全細胞生物傳感器，并系統性評估和表征了傳感性能，證實了其在高效篩選與鑒定細胞被膜靶向抗生素產生菌方面的可靠性、準確性和高效性。該生物傳感器不僅在微生物藥物篩選中具有較好應用，也為檢測體液或高度污染等環境樣本的抗生素殘留提供了潛在的工具。
技術路線
分析結果
1. 開發多功能全細胞生物傳感器，能夠檢測細胞被膜靶向抗生素 為了篩選用于開發抗生素敏感生物傳感器的調控元件，對S. coelicolor M1146進行了轉錄組學比較分析，其中桿菌肽、黃霉素和萬古霉素抑制了細胞壁的合成，多粘菌素E破壞了細胞膜的完整性。有91個基因在4種靶向抗生素處理組中共同差異表達(圖1c)，這表明盡管抗生素靶點不同，但仍有一些保守的反應。GO富集顯示，大多數基因參與與體內平衡相關的生物過程。從分子功能的角度來說，這些共同差異表達的基因主要與跨膜轉運蛋白復合物、ATP結合（ABC)轉運蛋白復合物以及其他轉運蛋白的功能相關 (圖1d)。 研究人員基于P2CS數據庫在S. coelicolor染色體上鑒定了188個TCS相關基因，他們編碼87個應答調節蛋白和101個傳感器組氨酸激酶。這些TCSs及其靶向啟動子可以用于定制生物傳感器，能夠以高靈敏度和特異性檢測抗生素。 圖1 轉錄組分析 2、利用VanS/R構建GPA依賴性全細胞生物傳感器 在差異表達的TCSs中，VanS/R TCS的應答調節蛋白VanR (SCO3590)為最顯著的差異基因(圖2a)，VanR同源的傳感器激酶VanS、VanS/R依賴性糖肽耐藥基因vanH, vanA和vanX以及其他VanS/R TCS相關基因vanK、vanJ在萬古霉素處理組中顯著上調(圖2b)。VanA與其同源蛋白DdlA在細胞壁合成中有協同作用。研究發現ddlA破壞后，細菌必須完全依賴于萬古霉素類的糖肽抗生素(GPAs)誘導的vanA表達來維持正常細胞壁的完整性(圖2c)。 通過用vanA取代必需基因ddlA來開發GPA依賴性全細胞生物傳感器，DdlA失活突變體WHY01在不添加萬古霉素的培養基中幾乎無法生長，只有在添加萬古霉素的培養基中才能正常生長(圖2e)。生物傳感器WHY01在≤0.5 μg/mL萬古霉素時，WHY01的生長受到抑制，而在≥0.75 μg/mL萬古霉素時，其生長良好(圖2f)。WHY01極低的檢出限使其能夠特異性地檢測低濃度的萬古霉素類的糖肽類抗生素，具有極大的應用潛力。 圖2 GPA依賴性全細胞生物傳感器WHY01的研制與表征 3、設計一種功能互補的生物傳感器，可用于高通量篩選GPAs產生菌株 在萬古霉素處理下，差異倍數最大的基因與VanS/R依賴性糖肽抗性(SCO3589- SCO3596)相關(圖3a)，包括vanSR (SCO3589和SCO3590);vanJ (SCO3592);vanK (SCO3593);和vanHAX (SCO3594、SCO3595和SCO3596)。PvanRS, PvanJ,, PvanK和PvanHAX 四個啟動子的表達量分別約為 1.0×103-fold, 6.0×103-fold, 6.4×103-fold和1.3×105-fold)(圖3b)。通過使用luxCDABE作為報告基因，選擇中等表達強度的PvanJ和最高表達強度的PvanHAX啟動子來單獨驅動luxCDABE的表達(圖3c)，構建了重組菌株WHY02和WHY03。總體而言， 含PvanHAX的重組菌株WHY03表現出更寬的動態范圍和更高的響應靈敏度，具有更優越的生物傳感器性能。使用WHY03實現了對不同GPAs生產菌株的發酵培養物中GPA的高靈敏度和準確性檢測(圖3)。 圖3 功能互補的GPA特異性生物傳感器的設計和表征，用于高效篩選GPA誘導菌株 4、開發具有更廣泛傳感能力的多功能生物傳感器 為了設計一種更通用、應用場景更廣泛的生物傳感器，通過比較轉錄組學和啟動子篩選相結合的研究模式，將傳感器的檢測范圍實現了由點（糖肽類抗生素）到面（細胞被膜靶向抗生素）的拓展，開發了可定向檢測包含糖肽類在內的各類細胞被膜靶向抗生素的全細胞生物傳感器。轉錄組分析發現有11個基因在所有處理條件下均上調表達，這些基因可能位于8個不同的操縱子區域(圖4a, b)。將這8個操縱子區域預測的啟動子與無啟動子的luxCDABE融合，一共得到8株重組菌株，其中含有PSCO3089的重組菌株在所有8個重組菌株中具有最卓越的性能，將其命名為WHY04，通過數學建模和性能測試， WHY04對各種細胞被膜靶向化合物表現出很高的靈敏度、快速的響應時間和較高的特異性(圖4)。 圖4檢測細胞被膜靶向抗生素的生物傳感器的開發、性能表征 5、細胞被膜靶向化合物合成的高通量篩選 為了進一步研究WHY04在高通量篩選細胞被膜靶向抗生素產生菌方面的應用潛力。利用WHY04對實驗室前期保藏的166株菌株進行了高通量篩選，鑒定出17株菌株的發酵上清液可顯著誘導WHY04產生發光信號，表明這些菌株可能合成了細胞被膜靶向的活性產物。該生物傳感器的創制可以顯著加快天然產物的挖掘速度，有望在新藥篩選方面得到極大的應用。
結 論
在本研究中，探索了S. coelicolor M1146對四種細胞被膜靶向抗生素的轉錄反應，確定能夠檢測并響應這些化合物的調控元件，以及也可以用作生物傳感器中的調控元件。開發了能夠檢測細胞被膜靶向抗生素的生物傳感器，通過采用數學建模和性能測試，全面評估了該生物傳感器的性能，該生物傳感器具有高動態范圍、廣泛的抗生素識別種類和明確的劑量-反應關系。這種優異的性能有效地克服了現有生物傳感器遇到的局限性，極大地促進了細胞被膜靶向的新型抗生素的發現。 圖5 研究路線
原文索引： [1]Wang, H., Sheng, Y., Ou, Y., Xu, M., Tao, M., Lin, S., Deng, Z., Bai, L., Ding,W., Kang, Q., Streptomyces-based whole-cell biosensors for detecting diverse cell envelope-targetingantibiotics, Biosensors and Bioelectronics (2024), doi: https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116004.
