2024-01-17
文章題目：Metabolic engineering of Paenibacillus polymyxa for effective production of 2,3-butanediol from poplar hydrolysate
技術手段：RNA-seq，代謝組學，qPCR
山東農業大學在著名雜志《Bioresource Technology》發表了關于多粘類芽孢桿菌利用楊樹原水解液生產2,3-丁二醇的新機制，為多粘類芽孢菌低成本工業化生產2,3-丁二醇奠定了基礎。本研究中轉錄組測序與代謝組檢測及部分分析工作均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
01、研究背景 2,3-丁二醇(2,3-BD)是一種重要的化合物，在可再生能源領域、制藥行業和化學合成領域有著廣泛的應用。大多數能夠產生2,3-丁二醇的菌種都有致病性，然而研究發現，多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）是一種安全的天然細菌，可以有效地產生純度≥98%的(R, R)-2,3-BD，因此，利用多粘類芽孢桿菌合成2,3-丁二醇的研究越來越受到人們的關注。本研究利用轉錄組學和代謝組學相結合的方法，鑒定了多粘類芽孢桿菌中葡萄糖衍生的2,3-丁二醇途徑及其相關基因，并通過直接敲除或過表達以提高2,3-丁二醇的產量。最后，在添加spo0A的情況下，對多黏類芽孢桿菌株SC2-M1進行了利用楊樹原水解液生產2,3-BD的試驗，為多粘類芽孢桿菌低成本工業化生產2,3-BD奠定了基礎,同時也為利用楊木原料水解物生產可再生燃料提供了一種新方案。
02、技術路線
03、研究內容 1.轉錄組和代謝組聯合分析揭示了P. Polymyxa SC2菌株生產2,3-丁二醇的合成和調控基因 將P.polymyxa SC2細胞在含0%葡萄糖(CK)和2%葡萄糖(SC)的LB培養基中培養。選擇培養6小時的細胞懸浮液進行轉錄組和代謝組分析。對轉錄組和代謝組數據進行KEGG富集分析發現，添加2%葡萄糖后對碳水化合物和能量代謝等通路有顯著影響，同時發現，P. polymyxa SC2在葡萄糖代謝、2,3-BD和副產物合成方面的基因發生了差異顯著(圖1)。值得注意的是，在丙酮酸生成2,3-BD的代謝途徑中，編碼乙酰乳酸合成酶(alsS)和乙酰乳酸脫羧酶(alsD)的基因轉錄水平顯著上調，而編碼丁二醇脫氫酶(bdh)的基因轉錄水平顯著下調。qPCR驗證后同樣發現bdh下調。分析發現，2,3-BD的合成過程中，有許多副產物如乳酸以及乙酸的產生與限制了編碼丁二醇脫氫酶(bdh)的基因的表達，導致2,3-BD的產生受到限制。 圖1糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑、三羧酸循環、2,3-BD合成途徑及部分副產物的轉錄調控分析 2.敲除乳酸脫氫酶基因能增加2,3-丁二醇的合成 在以葡萄糖為主要碳源培養P. polymyxa SC2的過程中，除了2,3-BD外，還產生了副產物。乳酸是一個重要的副產物，代謝組結果顯示其增加了1.3倍(圖1)。在P. polymyxa SC2中鑒定了兩個乳酸脫氫酶基因ldh1和ldh3。為了研究這兩個基因與乳酸和2,3-BD產生的關系，本研究對這兩個基因進行了敲除實驗。結果發現，僅敲除ldh3可顯著降低乳酸合成，增加2,3- BD產量。然而，ldh1的單一缺失并不影響乳酸的合成，而是促進了2,3-BD的產生，會略微上調ldh3和2,3-BD合成基因alsS、alsD和bdh的表達水平(圖2A),ldh1和ldh3共缺失菌株的2,3-BD產量略低于單缺失菌株，但產量較高比原菌株SC2-M1高出21%。此外，乙酰膽堿、乳酸鹽和乙醇含量顯著降低(圖2B)。 圖2 ldh1和ldh3基因敲除后菌株合成基因alsS、alsD和bdh的表達水平及代謝物變化 3.基因bdh的過表達進一步促進2,3-丁二醇的合成 轉錄組結果表明，bdh的下調可能是限制2,3-BD產生的因素之一，為了進一步提高2,3-BD的合成，我們在P. polymyxa M1-L31中過表達bdh基因。得到的菌株P. polymyxa M1-L31- Pb在相對需氧和弱酸性培養條件下生長良好(圖3A)。2,3-BD和乙醇合成初期使用葡萄糖作為營養物質(圖3B-C),隨著介質中的營養物質的消耗,菌株往往將2,3-BD乙偶聯,從而形成NADH維持其生理活動(圖3C)。過表達bdh菌株M1-L31- Pb的2,3-BD產量比菌株SC2-M1提高了22%，達到最大理論值的87%(圖3D)。 圖3 多黏芽孢桿菌M1-L31、M1-L31- Pb和SC2-M1在相對好氧和弱酸性培養條件下對葡萄糖的代謝能力 4.孢子形成基因spo0A和spoIIE對多粘芽孢桿菌細胞形態、代謝能力和2,3-丁二醇合成的影響 有研究表明，多粘類芽孢桿菌孢子的形成通常會影響底物的利用效率，延長發酵過程，在P. polymyxa中，敲除spo0A基因以丟失孢子會顯著降低2,3-BD的合成。為了探究孢子形成對多粘類芽孢桿菌合成2,3-BD的影響進行了以下研究。我們在葡萄糖以及充足氧氣的培養條件下發現，SC2（野生型）、SC2-M1（自然突變型）、M1-SP（spo0A基因恢復型）、M1- SPE（M1-SP菌株敲除spoIIE基因）和M1- SE (菌株SC2-M1中spoIIE基因的單缺失)5株菌株在培養初期表現出相同的生長趨勢(圖4A)。結果發現，在培養初期恢復菌株M1-SP和M1- SPE的spo0A基因，可大大提高菌株SC2的葡萄糖消耗量(圖4B-D)。培養12 h后，SC2和M1-SP的葡萄糖消耗量顯著高于菌株SC2-M1，菌株M1- SPE的葡萄糖消耗量顯著高于菌株M1-SE。結合轉錄組學數據推測,恢復spo0A可以增強葡萄糖的跨膜轉運，從而增加2,3-BD的產生(圖4B)。與菌株SC2-M1相比，與葡萄糖轉運相關的亞基基因在菌株M1-SP中顯著上調(圖4E)。結果表明，spo0A基因的恢復改善了葡萄糖的跨膜轉運，提高了細胞內葡萄糖含量，從而提高了2,3- BD的產量。雖然spoIIE的缺失使菌株M1-SPE在培養中后期促進了微生物的生長，但與菌株M1-SP相比，它不利于2,3-BD的合成。 圖4 多粘菌SC2、SC2- M1、M1-SP、M1-SE和M1-SPE的代謝能力以及葡萄糖跨膜轉運基因的轉錄水平 5．不同碳源和條件下工程多粘菌合成2,3-丁二醇的特性 培養基中氧的濃度對菌株的生長和發酵產物的合成有顯著影響。有研究表明，嚴格的好氧或厭氧條件不利于2,3- BD的合成。在好氧條件下，M1-L31-Pb和M1-L31-PbS在培養約27 h后均達到2,3-BD的最大產量(圖5D)。在限氧條件下，菌株的生長有所下降(圖5A),而2,3-BD的合成趨于穩定，2,3-BD的還原量明顯減少(圖5D),乙醇和乳酸的合成增加，但乳酸含量仍然很低(圖5F- G)。綜上所述，在好氧培養條件下，P. polymyxa生長較好，2,3-BD產量較高，但2,3-BD在后期容易被菌株分解且副產物濃度顯著升高，不利于培養后期2,3-BD的分離純化。雖然在限氧條件下，菌株的生長速度下降，但相同數量的細胞表現出良好的發酵性能，并且2,3-BD在發酵后期不易分解，副產物濃度低。 圖5 多粘菌M1-L31-Pb和M1-L31-PbS在好氧或限氧條件下對葡萄糖和木糖的代謝能力 本研究以楊樹的水解液為發酵底物，對工程菌株M1-L31-Pb和M1-L31-PbS在培養基的高密度發酵性能進行了評價。這兩種菌株在楊樹的原始水解液中生長良好，其發酵性能受不同發酵條件的影響較大。與菌株M1-L31-Pb相比， M1-L31-PbS對葡萄糖和木糖的利用效率和2,3-BD的合成效率更高，但2,3-BD的產量較低。然而，菌株M1-L31-PbS使更多的碳源用于乙醇合成(圖6B)。同時，葡萄糖和木糖也提高了菌株M1-L31-PbS的乙醇合成能力。使用楊木水解液的兩種工程菌株的2,3-BD產量普遍高于使用純葡萄糖和木糖的菌株，本研究中使用的工程菌株能產生纖維素酶，并繼續分解楊木原水解液中的大分子纖維素，以產生額外的碳源，如葡萄糖，最終達到更高的2,3-BD產量。本研究中，在缺孢菌株SC2-M1中添加Spo0A顯著提高了楊樹水解液中碳的利用效率，減少了長期發酵造成的碳損失，并阻止了野生型菌株SC2因孢子形成而導致的2,3-BD的分解。適度的孢子形成有利于2,3-BD的合成。菌株M1-L31-PbS利用楊木原水解液，2,3-BD的最大產量達到理論最大值的93%。 圖6 菌株M1-L31-Pb和M1-L31-PbS在生物反應器中利用楊樹水解液進行高密度發酵
04、結 論 本研究通過對多粘類芽孢桿菌轉錄組和代謝組的聯合分析，揭示了2,3-BD的合成途徑和一些限制因素。通過對多粘類芽孢桿菌基因組中的ldh1、ldh3、bdh、spo0A和spoIIE進行基因修飾，提高了2,3-BD的產量。該工程菌株通過發酵楊樹原水解液，2,3-BD產量最高可達0.465 g/g。2,3-丁二醇和乙醇的總得率為21.7 g/L。本研究為多粘類芽孢桿菌發酵生產2,3-丁二醇和乙醇提供了一種新的改進方法。
原文索引： Zhang Jikun,Zhao Jianzhi,Fu Quanbin et al. Metabolic engineering of Paenibacillus polymyxa for effective production of 2,3-butanediol from poplar hydrolysate.[J] . Bioresource Technology, 2024, 392: 130002.
