2024-01-16
近日，中國農業科學院茶葉研究所茶樹種質資源創新團隊在《Journal of Experimental Botany》發表新研究成果！本研究揭示了茶樹葉片白化性狀的主效數量性狀位點qChl-3，與鎂螯合酶I亞基（CsCHLI）的一個非同義多態性（G1199A）相關。本研究揭示了茶樹葉片白化形成的分子機制以及葉綠素生物合成與氨基酸代謝之間的關系，推進了茶樹重要農藝性狀的遺傳分析。
本研究的遺傳圖譜QTL定位、BSA定位、轉錄組測序分析均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
PART 1研究背景
茶樹（Camellia sinensis）由于其特有的次生代謝產物，包括茶氨酸、類黃酮和生物堿，具有重要的經濟和健康益處。"白雞冠"（BJG）是中國著名的光敏性葉綠素缺陷（葉片白化）茶樹品種，主要用于烏龍茶，因其獨特的表型和香氣而聞名。盡管對葉片白化茶樹植株的研究主要集中在基因表達調控上，但這一表型的遺傳基礎仍然不清楚。
本研究對葉綠素含量的數量性狀位點（QTL）進行分析，并鑒定了一個控制葉片白化表型的主效QTL（qChl-3），與鎂螯合酶I亞基（CsCHLI）中的一個非同義單核苷酸多態性（SNP）相關。揭示了CsCHLI在調控茶葉褪綠過程中的作用，為了解葉綠素生物合成與氨基酸代謝的關系提供了依據。
PART 2研究材料與方法
1.實驗材料：
‘龍井43’為母本，‘白雞冠’為父本的F1雜交群體；以‘白雞冠’為輪回父本構建的BC1群體。
2.測序平臺：
Illumina NovaSeq
3.分析內容：
遺傳圖譜構建與QTL定位、BSA定位、轉錄組、蛋白代謝分析、酶學分析等
PART 3研究結果
1.葉綠素缺陷表型QTL的鑒定
在高光條件下，"白雞冠"（BJG）茶樹的嫩芽表現出黃色葉片，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量相比于“龍井43號”（LJ43）顯著較低。通過將LJ43和BJG進行雜交得到F1代，綠色和黃色的子代個體呈1：1分離，表明葉綠素缺陷性狀受單基因控制。葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量在F1個體中存在差異，這些性狀在不同年份間穩定，并且主要受潛在基因型的影響。通過基因組測序的遺傳圖譜，在LG03染色體12.817–14.934 cM上鑒定了一個與總葉綠素含量相關，穩定且具有顯著效應的QTL（qChls-3），解釋了在三年時間內觀察到的表型變異的69.7–74.8%。
圖1 茶樹葉片白化基因的鑒定
2.qChl-3的候選基因是鎂螯合酶I亞基
為了進一步對主效QTL qChl-3進行定位，以‘白雞冠’為輪回父本構建了BC1群體，三種不同的葉片表型：綠色、淡綠色和白化，分離比約為1:2:1，表明BJG的葉片白化性狀由半顯性基因控制。采用BSA-seq和KASP分型相結合的策略，發現K37標記與qChl-3共分離，位于CsTGY08G0002006b。CsTGY08G0002006b編碼鎂螯合酶I亞基（CsCHLI），該基因的錯義突變（R400H）可能是導致‘白雞冠’葉色白化的原因。經UPLC-MS/MS分析，表明CsCHLI的等位基因阻礙了PPIX向Mg-PPIX的轉化。
圖2 主效葉片白化性狀 qChl-3的精細定位
3.擬南芥異源轉化
將含有由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子驅動的CsCHLIG和CsCHLIA等位基因的構建，引入擬南芥葉片白化表型突變體（Atchli1），進行了互補試驗。與Atchli1對照組相比，CsCHLIG過表達（OE）系表現出更綠、更大的葉片，以及較早的開花時間。OE-1和OE-2的表達分別增加了約300倍和500倍，導致OE-1和OE-2中葉綠素含量也顯著高于Atchli1對照。這些發現表明，CsCHLIG通過葉綠素含量的增加，恢復了Atchli1的葉片白化表型。
圖3 CsCHLIG 增加擬南芥chli1突變體的葉綠素生物合成
4.CsCHLI突變降低ATP酶活性
與葉綠素積累模式一致，CsCHLI在葉片中表達較高，在莖、根、花和果實中表達較低。亞細胞定位表明，CsCHLIG-GFP和CsCHLIA-GFP與葉綠體共同富集，而35S-GFP（對照）富集在細胞核和細胞質中。這些發現表明，CsCHLI正向調控茶葉葉綠素含量，錯義突變不影響CsCHLI的亞細胞定位。
酵母雙雜交和熒光素互補分析表明，CsCHLIG可以與CsCHLIG、CsCHLIA相互作用，CsCHLIG、CsCHLIA都可以與CsCHLD結合。然而，體內CsCHLIA之間的相互作用消失了。GST pull-down結果表明，CsCHLI的突變只影響了兩個CsCHLIA亞基之間的相互作用，而不影響CsCHLIA與CsCHLIG/CsCHLD之間的相互作用。
rCsCHLIA的ATP酶活性僅為rCsCHLIG的6.18%，而對照組（僅有MBP）沒有活性。當rCsCHLIA以等摩爾比例加入到含有rCsCHLIG的反應混合物中時，rCsCHLIG的ATP酶活性降低到兩個rCsCHLIG的51.84%。然而，兩個rCsCHLIA的ATP酶活性僅為兩個rCsCHLIG的3.95%。這些結果表明，CsCHLIA的ATP酶活性不足影響了BJG的葉綠素生物合成。
圖4 CsCHLI與CsCHLD的蛋白互作分析
5.CsCHLIA是氨基酸代謝的正調控因子
先前研究報道，茶樹的白化葉片中氨基酸含量比綠葉更高，但其潛在機制仍未知。研究人員測量了BC1群體中兩個純合基因型（綠色和白化）的根和葉中的22種氨基酸的含量，發現：22種氨基酸在兩個基因型的根中沒有顯著差異；白化葉片中大多數氨基酸的含量比綠色葉片高出10倍。白化葉片中沒有葉綠體，只有白色質體；綠色和淡綠色葉片中成熟和完全發育的葉綠體更豐富，且光系統II的最大量子產額（Fv/Fm）顯著高于白化葉片。通過RNA-seq，發現在綠葉和白化葉片中，與氮和氨基酸代謝相關的DEGs沒有明顯的表達趨勢。這表明白化葉片中氨基酸含量的整體性增加，主要與蛋白質降解有關，而不是激活氮和氨基酸的代謝。CsCHLIA等位基因是通過促進蛋白質降解，增加BJG中氨基酸含量的正調控因子。
圖5 氨基酸含量及與氨基酸代謝相關的DEGs的分析
PART 4結 論
本研究先通過遺傳圖譜構建進行茶樹葉片白化性狀QTL的粗定位，后通過BSA和KASP分型相結合的策略，精細定位到茶樹葉片白化性狀的候選基因CsTGY08G0002006b，編碼鎂螯合酶I亞基（CsCHLI）。結合擬南芥異源轉化、功能探究、RNA-seq等，證明了CsCHLIG在維持正常葉綠素生物合成中的重要作用，CsCHLIA介導的光損傷導致蛋白質降解，從而導致葉綠素缺陷葉片中氨基酸含量增加。本研究加深了對葉綠素和氨基酸代謝之間相互關系的理解，解析了‘白雞冠’葉色白化的遺傳機制，并推動了茶樹重要農藝性狀的遺傳分析。
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文章索引：Zhang C, Liu H, Wang J, et al. A key mutation in magnesium chelatase I subunit leads to a chlorophyll-deficient mutant of tea (Camellia sinensis)[J]. Journal of Experimental Botany, 2023: erad430.
