2024-01-10
文章題目：Periodontitis salivary microbiota exacerbates colitis-induced anxiety-like behavior via gut microbiota
南京大學醫學院附屬口腔醫院在《npj biofilms and microbiomes》上發表了牙周炎唾液微生物群可通過腸道微生物群加劇結腸炎誘導的焦慮樣行為的研究成果。本研究中代謝組和16s檢測及部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景 腸-腦軸是腸道與宿主腦活動之間的雙向影響通道。許多宿主相關因素如口腔細菌會影響腸道功能及菌群。唾液中含有大量口腔細菌，牙周炎唾液菌群可以改變腸道菌群。然而，牙周炎唾液菌群對腸-腦軸的影響和機制仍不清楚。
技術路線
研究內容 1、牙周炎唾液微生物群加重了DSS小鼠的焦慮樣行為 收集了19例患者的唾液菌群，其中牙周炎患者9例，健康者10例。基于Bray-Curtis的主坐標分析（PCoA）揭示了牙周炎唾液微生物群(PSM)和健康唾液微生物群(HSM)之間的差異（圖1a）。PSM的α-多樣性明顯高于HSM（圖1b）。在門水平上，與HSM相比，PSM中厚壁菌門的相對豐度降低了（圖1c）。在科水平上，與HSM相比，PSM中Streptococcaceae的相對豐度降低，Porphyromonadaceae的相對豐度增加（圖1d）。根據線性判別分析效應大小（LEfSe）分析，Porphyromonadaceae和Spirochaetaceae是PSM中主要的代表性科級分類群，而Streptococcaceae是HSM在科級水平上的代表性分類群（圖1e）。作者將混合的唾液微生物群灌胃給24只小鼠，使用DSS成功誘導結腸炎（圖1f）。 為了觀察唾液微生物群對焦慮樣行為的影響，我們進行了開放性、明暗轉換和高架+迷宮的行為測試。在空曠區，DSS組在邊緣區停留的時間較多，在中心區停留的時間較少，且速度較CON組慢。與H-DSS組相比，P-DSS組在邊緣區域停留的時間更長，速度更低（圖1g-h）。在明暗轉換中，DSS組的轉換頻率顯著低于CON組。與H-DSS組相比，P-DSS組在燈箱中花費的時間和在明暗箱之間轉換的頻率顯著降低（圖1i）。在高架+迷宮實驗中，DSS組小鼠的張開臂活動時間和進入張開臂的次數均低于CON組，P-DSS組小鼠的張開臂活動時間也低于H-DSS組（圖1j）。上述結果表明，DSS加重了焦慮行為，而PSM加重了DSS誘導的類焦慮行為。 圖1 牙周炎唾液微生物群加劇葡聚糖硫酸鈉(DSS)小鼠的焦慮樣行為 2、腸道菌群介導PSM加重DSS誘導的焦慮樣行為的作用 為了研究唾液微生物群改變的腸道微生物群對焦慮樣行為的影響，作者在牙周炎唾液微生物群灌胃后給DSS小鼠抗生素治療1周(圖2a)。ABX組、H-ABX組和P-ABX組在邊緣區域的活動時間和速度以及在空曠區域進入中心區域的次數上均無顯著差異(圖2a-c)。抗生素治療后各組之間的明暗轉換和高架迷宮行為結果也無顯著差異(圖2d-e)。這些結果表明，抗生素治療消除了兩組之間的行為差異，表明腸道微生物群是PSM加劇焦慮樣行為的關鍵因素。 為了進一步驗證腸道菌群在焦慮樣行為中的作用，我們從唾液菌群灌胃的小鼠中移植新鮮糞便菌群，并進行DSS治療，觀察行為變化(圖2f)。P-FMT組DSS小鼠在空地邊緣區域停留的時間明顯長于H-FMT組。它們在邊緣區域的速度和進入空地中心區域的頻率也有所降低，但不明顯(圖2g-h)。與H-FMT組相比，P-FMT組在光照下花費的時間、明暗盒子之間轉換的頻率、張開手臂的活動時間和進入張開手臂的次數顯著減少(圖2i-j)。這些行為結果表明，P-FMT組表現出與PSM相似的加劇焦慮樣行為，證實PSM通過腸道微生物群加劇了DSS誘導的焦慮樣行為。 圖2 腸道微生物群是牙周炎的關鍵，唾液微生物群加劇葡聚糖硫酸鈉誘導的焦慮樣行為 3、PSM通過腸道微生物群損傷神經元并激活大腦皮層的小膠質細胞 接下來，我們探討了PSM過程中焦慮相關的病理改變對焦慮樣行為的影響，包括免疫熒光法觀察小膠質細胞形態和尼氏染色法觀察正常神經元數量。Nissl染色結果顯示，與H-DSS組相比，P-DSS組大鼠大腦皮層正常神經元數量明顯減少，胞質實變，形狀不規則，神經元染色加深(黑色箭頭；圖3 a)。小膠質細胞的生物標志物電離鈣結合適配器分子1（Iba1）的染色顯示，與大腦皮層的H-DSS組相比，P-DSS組的小膠質細胞明顯皺縮，表明小膠質細胞被激活（圖3b）。 為了確定腸道微生物群在大腦病理改變中的作用，我們還檢測了抗生素處理和糞便微生物群移植小鼠中的小膠質細胞和神經元。在抗生素治療小鼠中，H-ABX組和P-ABX組之間神經元數量和小膠質細胞活化的所有差異都消失了（圖3c-d）。糞便微生物群移植實驗結果顯示，P-FMT組與H-FMT組相比，大腦皮層神經元數量和小膠質細胞激活明顯減少(圖3e-f)。因此，PSM可以減少正常神經元的數量，并通過腸道微生物群激活小膠質細胞，從而加劇焦慮樣行為。 圖3 牙周炎唾液微生物群通過腸道微生物群減少神經元數量并激活大腦皮層小膠質細胞 4、PSM改變了DSS小鼠腸道菌群的組成 為了研究腸道微生物群的變化，作者使用16s基因測序檢測了H-DSS組和P-DSS組的腸道微生物群組成。與H-DSS組相比，P-DSS組α-多樣性降低(圖4a)。PCoA顯示兩組之間腸道菌群組成存在顯著差異(圖4b)。在門水平上，P-DSS組厚壁菌門的相對豐度低于H-DSS組(圖4c)。在科水平上，P-DSS組Enterobacteriaceae和Bacteroidaceae的相對豐度高于H-DSS組(圖4d)。LEfSe分析表明，P-DSS組的代表性微生物群屬于Enterobacteriaceae，而H-DSS組主要是Firmicutes phylum、Muribaculacae和Prevotellaceae（圖4e）。隨機森林分析結果預測Enterobacteriaceae和Christensenellaceae可能是在P-DSS組中發揮作用的重要細菌群(圖4f)。最后，基于PICRUSt2標記的基因序列對H-DSS和P-DSS組腸道微生物群的功能預測表明，這些細菌的主要功能途徑富含代謝相關任務，包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔助因子和維生素的代謝(圖4g)。這些結果表明，PSM導致腸道菌群紊亂，這些紊亂可能與代謝物極化為氨基酸和碳水化合物代謝的改變有關。 圖4 牙周炎唾液菌群改變腸道菌群組成 5、PSM引起DSS小鼠腸道代謝物的改變 我們使用液相色譜-質譜法研究腸道代謝物的變化。分別對正負離子模式下篩選的代謝物進行正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)分析，發現P-DSS組和H-DSS組腸道代謝物存在顯著差異(圖5a)。采用Z-score分析觀察這些代謝物的相對水平；分別篩選出了P-DSS組和H-DSS組中最豐富的前五種代謝物(圖5b)。差異代謝物富集分析顯示，氨基酸代謝(組氨酸代謝和精氨酸生物合成)和神經遞質相關途徑(可卡因成癮、谷氨酸能突觸和氨基丁酸能突觸)是主要途徑，其中組氨酸代謝顯著變化(圖5c)。通過Spearman相關分析確定代謝物之間的相關性，與其他代謝物相比，NAH和氨基酸(arg-)具有明顯相反的趨勢，提示這些代謝物可能起著關鍵作用(圖5d)。最后，構建了這些代謝物及其途徑的網絡分析，氨基酸代謝(如組氨酸、精氨酸和脯氨酸)構成了大多數代謝物參與的途徑，其中l -谷氨酸和l -谷氨酰胺是關鍵節點，而在P-DSS組中，NAH是唯一參與這些途徑的高表達代謝物(圖5e)。值得注意的是，一些腸道代謝產物和相關途徑，如GABA能突觸和左旋多巴（在H-DSS組中含量較高），是參與焦慮樣行為的神經遞質。值得注意的是，一些腸道代謝產物和相關途徑，如GABA能突觸和左旋多巴（在H-DSS組中含量較高），是參與焦慮樣行為的神經遞質。 圖5 牙周炎灌胃后腸道代謝物的改變 6、PSM引起DSS處理小鼠腦代謝異常 接下來，我們檢查了大腦代謝，以探索影響焦慮樣行為的關鍵代謝產物。正離子模式和負離子模式的OPLS-DA分析結果顯示，H-DSS組和P-DSS組之間的代謝物存在顯著差異（圖6a）。對這些代謝物進行富集分析發現，它們主要富集于磷脂酰乙醇胺生物合成、組氨酸代謝、嘌呤代謝、肉堿合成、鞘脂代謝和天冬氨酸代謝(圖6b)。此外，與神經元相關的磷脂酰乙醇胺生物合成、磷脂酰膽堿生物合成和鞘脂代謝等通路也得到了豐富。代謝物表達差異如圖6c所示。P-DSS組主要差異代謝物高表達；因此，我們對P-DSS組升高的代謝物進行富集分析，發現嘌呤代謝、肉毒堿合成、蘋果酸-天冬氨酸穿梭、組氨酸代謝和葡萄糖-丙氨酸循環是前五大富集途徑(圖6d)。N-乙酰-L-組氨酸和N-甲基組胺在P-DSS組的腦代謝中高表達(圖6e)，而NAH在P-DSS組的腸道代謝中高表達(圖6f)。為了進一步探討腸道微生物群與代謝物之間的關系，我們基于腦代謝物、腸道代謝物和腸道微生物群的Spearman相關分析建立了相關網絡(P < 0.05)。以上結果表明，腸道微生物群與大腦和腸道代謝有關，組胺相關代謝物是PSM對焦慮樣行為影響的關鍵介質。 圖6 牙周炎唾液微生物群導致腦代謝的改變 7、N-乙酰組胺可能是PSM通過腸-腦軸促進焦慮的中介 最后，為了驗證腸道代謝物的作用，我們首先使用P-DSS組腸道中高表達的組胺相關物質NAH刺激小膠質細胞。我們發現，NAH可以增加小鼠BV-2小膠質細胞中CD86+/CD206 -的表達，而添加NAH后CD206+/CD86 -的表達下降，特別是在1 nM時(圖7a, b)。然后我們給DSS和非DSS小鼠灌胃10 nM的NAH(圖7c)。在行為水平上，NAH顯著增加了DSS處理小鼠在邊緣區域停留的時間，降低了進入空地中心區的頻率(圖7d-e)。同樣，與DSS組相比，DSS + NAH組的過渡時間和進入張開臂的時間更短，進入張開臂的頻率更低(圖7f-g)。在組織學水平上，Nissl染色顯示NAH灌胃使DSS小鼠正常神經元數量減少(圖7h)。免疫熒光顯示NAH激活的小膠質細胞，在DSS + NAH組中最為明顯(圖7i)。這些發現表明，腸道代謝物，如NAH，是促進DSS小鼠PSM焦慮樣行為的關鍵物質。 圖7 N-乙酰組胺可能是PSM通過腸-腦軸促進焦慮的中介
研究結論 研究將健康人唾液菌群及牙周炎患者唾液菌群灌胃至DSS誘導的小鼠，發現牙周炎唾液菌群可以加劇小鼠的焦慮樣行為。抗生素處理及糞菌移植實驗驗證了腸道菌群是牙周炎唾液菌群促進焦慮樣行為的關鍵因素。最后，通過代謝組學分析篩選出關鍵代謝物，并驗證其在牙周炎影響大腦活動中的關鍵作用。該研究發現牙周炎唾液菌群可以通過腸道菌群及其代謝物加劇結腸炎小鼠焦慮樣行為，表明牙周疾病可通過腸-腦軸影響腦活動，提示防治牙周疾病的重要性。
原文索引： Qian J, Lu J, Cheng S, Zou X, Tao Q, Wang M, Wang N, Zheng L, Liao W, Li Y, Yan F. Periodontitis salivary microbiota exacerbates colitis-induced anxiety-like behavior via gut microbiota. NPJ Biofilms Microbiomes. 2023 Dec 7;9(1):93. doi: 10.1038/s41522-023-00462-9. PMID: 38062089; PMCID: PMC10703887.
