2023-11-03
《ADVANCED SCIENCE》
影響因子：15.1
文章題目：Biomimetic Convex Implant for Corneal Regeneration Through 3D Printing 技術手段：RNA-Seq，qPCR，有限元模型（FEM）,熒光染色等 華南理工大學在國際著名雜志《ADVANCED SCIENCE》上發表了關于3D打印的凸面角膜植入物可以促進角膜再生的實驗成果，為角膜損傷的治療提供一種新策略。本研究中轉錄組測序及部分分析工作均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
由角膜損傷引起的失明影響著全世界數百萬人，而且這個數字還在持續上升。然而，快速上皮化和穩定的上皮過程是傳統角膜材料面臨的兩大挑戰。這些過程均與角膜曲率有關，角膜曲率是決定角膜愈合過程和角膜損傷時上皮行為的重要因素。在本研究中，生成了基于甲基丙烯酸明膠和膠原蛋白的光滑3D打印凸面角膜植入物。由于天然角膜不同區域的上皮分布和粘附性不同，本研究將角膜表面分為四個區域，并研究了細胞是如何感知曲率的調控線索，角膜損傷的治療提供一種新的轉化策略。
技術路線
研究內容
1.溫控技術抑制3D打印角膜植入物過程中存在的臺階效應 3D打印是基于溫度控制和打印路徑的技術（圖1A,B），為了保證打印成功，我們為角膜植入物設計了一種具有溫度敏感性的紫外固化水凝膠體系，通過溫控3D打印技術尋找最合適的打印溫度（圖1C），抑制了傳統的打印參數3D打印角膜植入過程中存在的臺階效應，制備具有曲率結構的光滑表面角膜修復材料，用于促進角膜基質再生和角膜功能恢復。 圖1 3D打印角膜制備工藝優化圖及角膜實物圖 2.曲面對兔角膜上皮細胞形態和取向的調節以及對細胞粘附和染色質凝聚的促進作用 將兔角膜上皮細胞(RCECs)接種于凸面結構體上，觀察到細胞在凸面構體上的增殖比在平面構體上的增殖慢。隨著時間的推移，由于增殖速率的不同，細胞傾向于縱向增殖，為了進一步研究斜度梯度對細胞行為的影響，我們按照眼科學領域的方法，將凸面結構分割為四部分（圖2D），如圖2A所示培養5 d后，凸構體上的RCECs的f -肌動蛋白大部分沿縱軸排列（圖2E-I）。因此猜測當角膜曲率在一定正常范圍內，曲面比平面更能促進細胞的定向排列。 圖2 曲率角膜具有調控RCECs細胞取向和排列形態的功能 由于上皮細胞粘附是角膜再生的關鍵因素，因此我們研究了vinculin蛋白的粘附行為，以確定其與打印形態的相關性。通過計算了不同部位的粘附力發現，凸面結構可以增強附著力，不同坡度的附著力不同，坡度越陡附著力越強（圖3A）。為了進一步研究導致粘附差異的機制，我們使用半定量的手段研究了mRNA表達(圖3B)和蛋白水平(圖3C)的變化，這些結果表明，與平面種植體相比，曲面種植體不僅能促進細胞的粘附行為，而且曲面的斜率對細胞粘附力的調節也起著重要的作用。我們接下來研究曲率如何影響它們的細胞核。采用基于DAPI染色的定量程序來研究曲率對細胞核行為的影響，凸面曲率上細胞的DAPI染色更強，同時細胞核體積減小，染色質凝結有從外圍向中心開始的趨勢（圖3F-H）,核上mRNA水平的檢測也可以證實這一點（圖3I）。通過以上結果，我們觀察到細胞核的變形和染色質凝聚與細胞在曲面上的不同行為有關，并證實了細胞核在調節RCEC形狀和粘附方面的作用。 圖3 曲率角膜能提高RCECs的黏附能力，促進細胞核收縮和染色質凝縮 3.有限元模型（FEM）分析角膜基質上的細胞間相互作用力 為了更好地了解角膜曲率對細胞組織的影響，我們隨后采用基于COMSOL軟件的有限元模擬（FEM）來分析觀察到的細胞自組織行為（圖4）。我們的有限元模擬預測了細胞層粘附在角膜基質上的細胞間平面內應力和細胞-基質相互作用力，由于細胞水平的化學結構與力學之間的耦合作用，細胞通過細胞或細胞骨架的極化和排列來響應細胞間的受力，從而改變細胞層的受力狀態。 圖4 有限元模型（FEM）分析曲率角膜不同坡度上RCECs的受力狀態 4.3D打印曲率角膜在兔子體內有效性驗證 為了進一步研究材料(平面/凸面)是否會影響角膜修復，我們使用兔角膜缺損模型開展了3D打印曲率角膜的測試實驗，我們將3D打印的平面和凸面角膜植入體分別移植到兔子眼球中，由圖中可以看出，平面植入體在與受體床的連接處明顯翹曲，而凸面植入體在手術后與所有缺陷部位貼合良好，這可能是由于彎曲結構具有更大的可塑性(圖5B,C)。隨著時間的推移，在整個實驗過程中，凸面植入體的上皮化過程保持穩定，而平面組由于植入體融化而未能完成再生（圖5D,E），這表明曲率角膜在短期內能促進上皮黏附，而平面角膜無法做到。 圖5曲率角膜在兔子體內的有效性驗證 接著進行長期的修復有效性的觀察（圖6），結果發現3D打印的凸面角膜的實驗組，基質再生能力強，角膜厚度恢復，角膜透明，神經再生，而對照組修復效果不理想，說明3D打印曲率角膜具有臨床應用的前景。 圖6 兔板層角膜移植術模型術后60天和180天的評價 5.轉錄組幫助深入探究曲率角膜調控RCECs行為的機制 在這一過程中，我們除了研究細胞骨架形狀、細胞內張力和粘附特性的變化外，同時也進一步研究了曲率是否會影響RCECs中的基因表達。我們進行了3D打印平面角膜和凸面角膜上的RCECs的轉錄組測序，測序結果發現，與平面角膜組相比，凸面角膜組有52個基因顯著上調，112個基因顯著下調（圖7A）。從FA通路186個基因的鑒定來看(圖7B)，一些與整合素通路相關的影響粘附和細胞骨架的基因發生了顯著變化，包括整合素家族(ITGAv、ITGA5和ITGA6)，FA基因(PXN和PTK2/FAK)，以及其他與整合素通路相關的基因(ACTN1、ROCK1等)，結合我們上述結果中的qPCR實驗發現，曲率通過基于整合素的粘附和轉導信號通路被轉導為生長因子（圖7C），通過了解這些內部的機制可以進一步指導材料的形態設計，并闡明它們在曲率感知調節中的作用。 圖7 曲率角膜誘導兔角膜上皮細胞(RCEC)行為變化及信號轉導通路預測的示意圖
結 論
綜上所述，兔角膜上皮細胞(RCECs)在凹凸結構上更陡峭的曲率表面上，細胞組織排列更整齊，細胞-底物粘附更緊密，這也可以通過有限元模擬和信號通路分析得到驗證。相比于平面角膜植入體，凸面植入體在體移植時與鄰近組織的貼合更好，細胞黏附更強，可在180天內加速角膜上皮化，促進膠原纖維和神經再生。綜上所述，打印的凸面角膜植入物可以促進角膜再生，為角膜損傷的治療提供一種新的轉化策略，這一發現加速了3D打印領域的進展。
原文索引： Xu Yingni., Liu Jia., Song Wenjing., Wang Qianchun., Sun Xiaomin., Zhao Qi., Huang Yongrui., Li Haochen., Peng Yuehai., Yuan Jin., Ji Baohua., Ren Li.(2023). Biomimetic Convex Implant for Corneal Regeneration Through 3D Printing. Adv Sci (Weinh), 10(11), e2205878. doi:10.1002/advs.202205878
