2023-10-30
《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》
影響因子：5.7
近日，上海交通大學農業與生物學院和生命科學技術學院聯合在微生物領域期刊《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》發表最新研究成果！本研究從根際土壤中分離出B.velezensis 504，該菌株對稻瘟病、蔬菜灰霉菌和橡膠樹葉炭疽病等植物病原真菌具有拮抗作用，為防治植物病原菌提供了更廣闊的選擇。
本研究的細菌基因組，轉錄組測序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
細菌性條紋病（BLS）是由水稻黃單胞菌引起的一種嚴重病害。稻瘟病已逐漸成為我國南方部分水稻產區水稻的第四大病害。本研究分離出一株對Xoc野生型菌株RS105表現出明顯拮抗活性的Bacillus velezensis 504，并發現B.velezensis 504是BLS的潛在生物防治劑。然而，拮抗和生物控制的潛在機制還沒有完全了解。在這里通過基因組和轉錄組數據，揭示了B.velezensis對BLS的潛在生物控制機制，并表明B.veleznsis 504是一種多功能的植物益生菌。
研究材料與方法
1.實驗材料：從根際土壤中分離出的B.velezensis 504
2.測序平臺：Illumina +Pacbio
3.分析內容：細菌基因組完成圖、ANI分析、共線性分析、基因家族分析、轉錄組測序等。
研究結果
1.B.velezensis 504的基因組特征和比較基因組學分析
本研究從根際土壤樣本中提取出對Xoc有顯著拮抗活性的菌株 504。菌株504染色體基因組大小約為3.91M，GC含量46.6%，3853個蛋白質編碼序列（CDSs）、27個rRNA基因、86個tRNA基因和217個其他非編碼RNA基因；質粒基因組大小約為8.56k，GC含量39.86%。
圖1 菌株504基因組圈圖
ANI結果顯示菌株504與B.velezensis FZB42和SQR9的ANI超過95%，高于物種劃分閾值，證實了菌株504為B.velezensis，這與菌鑒結果一致。
表1 ANI分析
共線性分析結果表明B.velezensis 504、FZB42和SQR9大多數基因具有高度同源性，但也存在基因重排翻轉和換位等現象。核心泛基因組分析顯示在B.velezensis 504、FZB42和SQR9中有3306個核心基因，B.velezensis 504有280個特有基因。anti-SMASH分析顯示B.velezensis 504的基因組包含14個參與非核糖體合成的候選基因簇脂肽（表面活性素、豐霉素和桿菌素）、聚酮（艱難梭菌素、桿菌素、大分子乳酸菌素和木霉素），二肽抗生素（桿菌溶素）、細菌素的核糖體合成（車前草素）、布松松糖的合成及其他四種未知萜烯、聚酮和非核糖體肽合成酶，通過比較分析推測difficidin和bacilysin是B.velezensis 504拮抗Xoc RS105的主要細胞外活性分子。
圖2 B.velezensis 504與其他B.veleznsis菌株的比較基因組分析
2.比較轉錄譜分析
實驗發現B.velezenis 504阻止Xoc的生長，很可能是通過可在0.22mm濾膜上擴散的合成代謝產物。通過RNA-Seq和qRT-PCR發現2743個基因（1381個下調，1362個上調）對應于77%的Xoc RS105編碼序列（CDS）由B.velezensis 504的CFS差異表達。此外，我們對Xoc RS105進行了比較RNA-seq由B.velezensis 504的CFS在6小時、12小時和24小時誘導產生的Xoc RS105進行了RNA-seq分析，由B.velezensis 504的CFSs處理期間表達發生顯著變化，435個DEGs下調和316個DEGs上調。
圖3 B.velezensis 504 CFSs處理下的RS105轉錄組概述
3.B.velezensis 504的CFSs影響代謝、跨膜轉運、細胞運動、DNA翻譯和信號轉導
B. velezensis 504 CFSs影響RS105中能量產生和轉化途徑相關基因的表達，包括乙醛酸和二羧酸代謝（ko00630）、丁酸代謝（ko00650）、丙酮酸代謝（ko00620）等生化代謝反應過程。RNA-Seq分析發現，在B.velezensis 504 CFSs處理下，glnA（ACU12_RS19795）、lpdA、ACU12_RS17850)和katB（ACU12_RS01600）在6、12、24 hpi時表達下調，這與qRTPCR分析一致。這些結果表明，與核苷酸、碳水化合物、氨基糖、核苷酸糖和氨基酸代謝相關的基因受到了B.velezensis504 CFSs的抑制，且其可以抑制Xoc RS105的鞭毛組裝過程。綜上，B.velezensis504可能通過影響整個代謝途徑、跨膜轉運、細胞運動性、DNA翻譯和信號轉導來發揮抗菌活性。
圖4 RS105對B.velezensis504 CFSs的轉錄響應
圖5 qRT-PCR檢測基因表達
4.毒力基因分析
Xoc在宿主水稻組織中的發病依賴于一些關鍵的毒力因子，包括III型分泌系統（T3SS）、脂多糖（LPS）、胞外多糖（EPS）、粘附素、胞外酶、毒素、細胞運動等。研究結果表明B.velezensis 504的CFS可能通過下調與T3SS、T2SS、T4P、T6SS、EPS和LPS產生等毒力因子相關的關鍵毒力基因來發揮生物防治作用。
圖6 RS105毒力基因對B.velezensis504處理的CFSs的轉錄響應
5.4.B. velezensis 504有效拮抗植物病原菌
對秈稻、秈稻和原豐早3個敏感品種進行了田間試驗，結果表明，B.velezensis504的CFSs能有效抑制Xoo PXO99A的生長，對IR24具有有效的生物防治作用。綜上所述，B.velezensis504是一種很有前途的水稻BB生物防治劑。
圖7 B.velezensis504在田間防治Xoo PXO99，的效果
一些相對于植物益生菌性狀的分析表明 B. velezensis 504可以分泌蛋白酶并產生鐵載體，但沒有纖維素酶活性和降解無機磷和鉀的能力。且B.velezensis 504對稻瘟病、蔬菜灰霉菌和橡膠樹葉炭疽病等植物病原真菌具有拮抗作用，說明B.velezensis504是一種多用途的植物益生菌。
圖8 B.velezensis504能有效地拮抗一些重要的植物病原真菌，促進植物生長
結 論
本研究分離得到了一株新菌B.velezensis504，是一種潛在的植物病害生物防治資源，具有較強的抗菌和抗真菌活性，以及促進植物生長的性狀。此外，基因組和轉錄組分析揭示了生物防治劑如何損害病原體和干擾細菌生長的機制，為農業中的生物防治提供了基礎。
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文章索引：Qi Zhou, Min Tu, Xue Fu, et al. Antagonistic transcriptome profile reveals potential mechanisms of action on Xanthomonas oryzae pv.oryzicola by the cell-free supernatants of Bacillus velezensis 504, a versatile plant probiotic bacterium[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, (2023) 13:1175446.
