2023-10-19
《Molecular Plant》
影響因子：27.5
中國科學院分子植物科學卓越創新中心陳曉亞院士團隊，在國際著名期刊《Molecular Plant》上發表單細胞轉錄組揭示棉花萜類化合物的生物合成及調控機制的研究成果。本研究的單細胞轉錄組測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
NO·01、研究背景 萜類化合物是一類多樣化的代謝產物，自然存在的萜類化合物超過50000種。植物在應對不同環境時會合成不同的萜類化合物，一些特殊的萜類化合物在傳粉、種子傳播和防御等過程中發揮重要的作用，它們的合成發生在植物的特定器官。腺體存在于棉花的葉片、莖和種子中，負責積累各種非揮發性萜類化合物（例如棉酚），這些萜類化合物的合成源于甲羥戊酸途徑（mevalonate(MVA) pathway）。為了抵御植食性昆蟲的侵襲，棉花葉片釋放復雜的揮發性萜類。盡管一些研究已經報道了萜類化合物合成酶和轉錄調控因子的鑒定，然而不同萜類化合物的時空調控仍然缺乏清晰的認識。
NO·02、研究思路
NO·03、研究結果 結果1、scRNA-seq揭示棉花真葉單細胞表達圖譜 作者通過scRNA-seq 獲得了發育15天的棉花真葉組織單細胞，共捕獲22163個高質量細胞。通過聚類分群得到14個clusters，通過marker基因注釋和原位雜交驗證鑒定到6種細胞類型：分別是葉肉細胞（MCs）、表皮細胞（ECs）、保衛細胞（GCs）、維管束細胞（VCs）、增殖細胞（PCs）和分泌型腺體細胞（SGCs）。單細胞表達圖譜揭示了棉花真葉的細胞異質性，與葉片解剖學觀察的結果一致。 圖1. 陸地棉真葉的單細胞轉錄圖譜 結果2、萜類化合物合成基因特異表達在腺體細胞（SGCs） GO富集分析顯示，腺體細胞（SGCs）特異表達的marker基因富集到類異戊二烯生物合成通路，表明腺體細胞（SGCs）具有活躍的次生代謝（圖2A）。原位質譜顯示半棉酚、棉酚和半棉酚酮等均在腺體中特異性積累（圖2B）。為了確定棉酚合成通路在葉片中的空間分布，作者在單細胞水平檢測了棉酚合成通路基因的表達模式，發現已知棉酚合成途徑及其上游甲羥戊酸途徑(mevalonic acid pathway, MVA pathway)酶編碼基因均在棉花腺體細胞中特異表達（圖2C），暗示了棉酚途徑和上游的甲羥戊酸途徑可能是受到共同調控。此外，4個編碼揮發性單萜和倍半萜合成的萜類合酶基因（GhTPS1，GhTPS2，GhTPS3和GhTPS6）同樣特異高表達在腺體細胞（圖2D-E）。 圖2. 非揮發性和揮發性萜類在分泌型腺體細胞中合成 結果3、棉花HSFA4a和NAC42調控腺體細胞中萜類化合物合成 通過單細胞技術對腺體細胞類型的鑒定及特異表達基因的獲取為研究者提供了挖掘新調控因子的機會。作者結合單細胞和多組織轉錄組數據，精確鑒定到了兩個新的、特異表達在腺體細胞中的轉錄因子GoHSFA4a和GoNAC42（圖3A-B)。利用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術誘導GoHSFA4a和GoNAC42基因的轉錄后沉默，發現腺體發育不受影響，但MVP途徑的萜類化合物和MEP途徑的單萜化合物合成顯著減少（圖3C-E），相關基因表達也顯著降低（圖F）。進一步，作者利用PlantPAN 4.0預測GoHSFA4a和GoNAC42的順式作用元件，表明它們可能與MVA和棉酚合成途徑基因的啟動子區域結合。雙熒光素酶、EMSA和酵母單雜交實驗表明GoHSFA4a直接與HMGs、CYP736A196基因啟動子結合，而GoNAC42與HMGR和DH1基因啟動子結合（圖3G-J）。這些結果表明GoHSFA4a和GoNAC42通過激活特定的MVA和棉酚途徑基因調節棉酚型代謝物的生物合成。 圖3. GoHSFA4a和GoNAC42調控腺體細胞中萜類化合物合成 結果4、GoPGF直接調控GoHSFA4a和GoNAC42基因表達 GoPGF是棉花腺體發育和棉酚合成的重要調控基因，為了探究GoPGF與GoHSFA4a、GoNAC42的關系，作者檢測了GoPGF基因沉默葉片中GoHSFA4a、GoNAC42基因的表達，發現GoHSFA4a、GoNAC42基因的mRNA水平在GoPGF基因沉默組顯著減少（圖4A）。CHIP-seq分析顯示GoPGF直接結合到GoHSFA4a和GoNAC42的啟動子上（圖4B）。EMSA、酵母單雜交和雙熒光素酶實驗進一步驗證了CHIP-seq的結果（圖4C-E）。 圖4. GoHSFA4a和GoNAC42基因受GoPGF和逆境信號調控 結果5、GoHSFA4a和GoNAC42可能是重要的防御調控因子 植物在應對病原菌和植食性昆蟲侵襲時，萜類化合物作為一種植物抗毒素，其合成會增加。為了探究GoPGF-GoHSFA4a/GoNAC42調控模塊是否參與植物對病原菌和昆蟲的抵抗，作者分別檢測了大麗輪枝菌（Verticillium dahliae isolate V592）和棉鈴蟲侵襲的棉花葉片中三個基因的表達，發現GoHSFA4a、GoNAC42在侵襲組中葉片中表達量顯著升高，但GoPGF沒有升高的趨勢，暗示GoHSFA4a和GoNAC42在防御調控上具有更重要的功能。
NO·04、總 結 作者利用scRNA-seq技術建立了棉花真葉的單細胞轉錄圖譜，鑒定到揮發性和非揮發性萜類代謝物合成的細胞類型，結合多組織轉錄組數據挖掘到兩個調控萜類化合物合成的關鍵轉錄因子，確定了它們的上、下游調控基因，在單細胞水平上構建了一條調節萜類代謝物生物合成的級聯轉錄調控網絡。
派森諾單細胞項目經驗 派森諾生物具有豐富的單細胞項目經驗，涵蓋人、鼠、猴、雞、豬、羊、斑馬魚、團頭魴、鯽魚、鱖魚、蛙、蝌蚪、水稻、楊樹、小麥、玉米、苜蓿、大豆、棉花、番茄、煙草、南瓜、小青菜、胡蘿卜、川穹、檀香、蘆葦、油桃、石斛、人參、牛至、金錢松、金銀花、桑葚、丹參、工業大麻等模式及非模式物種，涉及腫瘤、肝臟、肺、角膜、視網膜、皮膚、胃黏膜、血管、血液、心臟、回腸、脛骨、睪丸、肌腱、胚胎、植物根、莖、葉、芽、花序、花藥、果實、種子等多種組織類型，積累了豐富的細胞解離和分析經驗，助力更深、更廣的科研探索。
