2023-10-09
《Nature Communications》
影響因子：16.6
前言 近日，中國農業科學院茶葉研究所聯合暨南大學等高校在《Nature Communications》發表新研究成果！本研究揭示了茶葉中參與兒茶素O-甲基化合成的兩種O-甲基轉移酶的特性，這些酶在茶葉中起著關鍵的作用，參與了甲基化兒茶素的生物合成過程。這些發現可為高O-甲基化兒茶素茶品種的培育提供指導。 本研究的BSR測序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
茶葉中的兒茶素的主要成分表沒食子兒茶素酸酯 (EGCG),具有重要的生物活性，包括潛在的抗癌和抗炎作用。然而，EGCG的腸道穩定性和滲透性較差，限制了其在人體內的吸收和利用，從而降低了其健康益處。O-甲基化兒茶素是一類在少數茶葉品種中以低水平存在的衍生物，具有較高的生物利用度。 本研究鑒定了參與茶葉中O-甲基化兒茶素生物合成的兩種O-甲基轉移酶（OMT）。這兩種酶分別催化EGCG的3″-位置和4″-位置進行O-甲基化，生成EGCG3″Me和EGCG4″Me。研究人員通過BSR-Seq分析，進一步研究了CsFAOMT1和CsFAOMT2在不同茶葉組織和種質中的表達水平與相應O-甲基化兒茶素含量之間的關系，進一步揭示了結構特征和催化機制。 圖 1 O-甲基化兒茶素的生物合成途徑
研究材料與方法
1.實驗材料 金萱JX，紫娟ZJ及其F1雜交群體 2.測序平臺 Illumina NovaSeq 3.分析內容 BSR分析，差異基因表達分析，晶體結構分析，酶活性分析等
研究結果
1.克隆候選O-甲基轉移酶基因 研究人員將“金萱JX”和“紫娟ZJ”進行雜交，獲取F1群體，選擇EGCG3″Me含量高(>5 mg/g?1)和EGCG3″Me含量低(<0.1 mg/g?1 )的24個個體組成兩個極端組(H/L組)，通過BSR分析，發現與該性狀相關的變異富集在6號染色體上約46 Mb的區域，共鑒定出217個差異表達基因，在94個上調差異表達的基因中，HD.03G0010060、HD.03G0009980、HD.03G0009970、HD.03G0009860、HD.06002937為推測的OMT。對27種不同遺傳背景的茶葉進行RNA-seq，分析發現HD.03G0010060表達水平較高的茶葉往往含有更多的EGCG3″Me，該基因命名為CsFAOMT1。后經基因克隆，從JX cDNA中分離了一個新的OMT基因CsFAOMT2。CsFAOMT1和CsFAOMT2與葡萄中的黃酮醇和花青素O-甲基轉移酶(FAOMT)密切相關，但與茶葉的CCoAOMT相對較遠。 圖 2 BSR分析及OMT的系統發育分析 2.EGCG3′′Me含量與CsFAOMT1密切相關 通過CsFAOMT1在不同組織的轉錄水平、EGCG3″Me積累測定，發現CsFAOMT1在嫩葉中的轉錄水平最高，緊隨其后的是花蕾，但在成熟葉、花、老葉、根和種子中要低得多，這與EGCG3″Me在不同組織中的檢測水平基本一致。結合對來自F1群體的20個個體和27份不同遺傳背景的茶葉種質進行qRT-PCR，證實CsFAOMT1轉錄水平與EGCG3″Me積累呈顯著正相關。 圖 3 EGCG3′′Me含量與CsFAOMT1密切相關 為了鑒定CsFAOMT1的酶活性，使用大腸桿菌中表達的重組蛋白進行體外甲基化測定，對產物進行超高效液相色譜（UPLC）和液相色譜質譜儀（LC-MS）分析。發現CsFAOMT1表現出顯著的3″-O-甲基轉移酶活性，以Mg2+依賴的方式將EGCG轉化為EGCG3″Me。將EGCG注射到瞬時表達CsFAOMT1的煙草葉片中，證實CsFAOMT1確實在體內負責EGCG3″Me的生物合成。以上結果表明，CsFAOMT1可催化EGCG的3″-O-甲基化。 圖4 鑒定參與茶葉中EGCG轉化為EGCG3″Me的3″O-甲基轉移酶 3.CsFAOMT2在EGCG上具有4″-O-甲基轉移酶活性 CsFAOMT2只能從含有EGCG4″Me的茶葉的cDNA中分離出來。同樣的，發現CsFAOMT2的轉錄水平也與EGCG4″Me的積累量呈正相關。CsFAOMT2在EGCG上主要具有4″-O-甲基轉移酶活性，而3″-O-甲基轉移酶活性較低。此外，還生成了兩種痕量的二甲基化EGCG產物（EGCGdi-Me1和EGCGdi-Me2），但由于缺乏3″，4″-二甲基EGCG和3″，5″-二甲基EGCG的標準樣品，無法進行區分。 圖5 鑒定參與茶葉中EGCG轉化為EGCG4″Me的4″O-甲基轉移酶 4.CsFAOMT1和CsFAOMT2的底物廣泛性 通過底物廣泛性研究，發現CsFAOMT1和CsFAOMT2在EC作為底物時幾乎沒有表現出活性，但很容易將ECG(含有沒食子酰基)轉化為甲基化形式。除了EC外，其他酚類底物都被CsFAOMT1僅轉化為一種甲基化產物；除了花青素3-O -葡萄糖苷外，其他酚類底物都被CsFAOMT2轉化為不同的單甲基產物。 圖 6 CsFAOMT1和CsFAOMT2體外甲基化兒茶素、酚酸、黃酮醇和花青素的UPLC色譜圖 5.CsFAOMT1和CsFAOMT2的動力學分析 為了進一步驗證CsFAOMT1和CsFAOMT2的O-甲基化活性，使用EGCG作為底物進行了動力學分析。在最佳反應條件下，CsFAOMT2對EGCG的親和力強于CsFAOMT1，具有較高的催化效率；與EGCG相比，CsFAOMT1對ECG表現出更高的親和力和更高的效率。可能是ECG含量較低的原因，茶葉中ECG3″Me的含量與EGCG3″Me呈正相關，但顯著低于EGCG3″Me。 圖7 CsFAOMT1和CsFAOMT2的穩態動力學分析 6.CsFAOMT1和CsFAOMT2的晶體結構揭示了底物識別的關鍵殘基 為了解釋CsFAOMT1和CsFAOMT2的特異性，在EGCG和S-腺苷-L-半胱氨酸（SAH）的存在下結晶，并以2.0?的分辨率測定了CsFAOMT1和CsFAOMT2的結構。這兩種結構都表現出典型的羅斯曼折疊和類似于其他陽離子依賴性OMTs的二聚體排列。SAH和Mg2+的電子密度得到了明確的分配，但在這兩個結構中都沒有發現EGCG。CsFAOMT1和CsFAOMT2的單體結構重疊在190個排列殘基的Cα原子上的均方根偏差為0.36 ?，其中最顯著的差異發生在底物結合袋附近的α-螺旋(α9)上。在CsFAOMT1中，α-螺旋向口袋方向彎曲，形成一個深而窄的底物結合間隙，而在CsFAOMT2中，相應的α-螺旋向相反方向彎曲，形成一個相對開放和淺的間隙。 鑒于CsFAOMT1和CsFAOMT2具有超過90%的序列同一性，它們不同的位置偏好可能是由于微小的可變殘基微妙地影響了化學環境或構象，因此特別關注了Mg2+周圍的殘基，因為它們可能在協調EGCG的D環和使目標羥基與Mg2+對齊方面發揮關鍵作用。隨后鑒定了兩個序列變量殘基:CsFAOMT1-L50 (CsFAOMT2-M50)和CsFAOMT1-Y184 (CsFAOMT2-R184)。通過突變這兩種殘基進行體外酶測定，兩者功能發生了一定逆轉，闡明這些殘基在底物結合中為催化關鍵氨基酸。 圖 8 CsFAOMT1和CsFAOMT2的晶體結構
結 論
本研究成功鑒定和表征了茶葉中參與O-甲基化兒茶素生物合成的兩種O-甲基轉移酶，CsFAOMT1和CsFAOMT2。CsFAOMT1主要在EGCG的3″-位置催化O-甲基化反應，而CsFAOMT2主要在EGCG的4″-位置催化O-甲基化反應。研究還確定了CsFAOMT1和CsFAOMT2的關鍵殘基和催化位點，揭示了催化機制和結構特征。這些研究結果對于培育富含O-甲基化兒茶素的茶葉品種和開發新的茶葉產品具有重要的指導意義。通過了解O-甲基轉移酶的功能和調控機制，可以更好地理解茶葉中O-甲基化兒茶素的生物合成途徑，并為茶葉的品質改良和功能性開發提供科學依據。
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文章索引：Jin J Q, Qu F R, Huang H, et al. Characterization of two O-methyltransferases involved in the biosynthesis of O-methylated catechins in tea plant[J]. Nature Communications, 2023, 14: 5075.
