2023-09-04
《Science of the Total Environment》 影響因子：9.800 近日，上海交通大學醫學院在微生物基因組領域的《Science of the Total Environment》發表最新研究成果！本研究針對分離得到的大腸桿菌基因組進行研究，發現一個具有193kb保守區域的tet（X4）陽性質粒，其可以在各種細菌物種和來源之間轉運，具有宿主間轉移和時空傳播的能力，對公眾健康構成重大威脅。 本研究的細菌基因組測序由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。 研究背景 抗生素耐藥性被世界衛生組織視為全球十大公共衛生威脅之一，每年有70多萬人死于抗微生物感染。73%的抗菌藥物在食用動物中的使用量是人類臨床試驗的3倍以上，抗生素的誤用和濫用導致動物體內頻繁出現多重耐藥細菌。研究表明，在不同的動物中發現了抗生素耐藥基因，并且這些基因可以從動物傳播給人類，其中在動物和人類中出現的質粒介導的替加環素耐藥基因tet(X3-X6)引起了重點關注。然而，迄今為止，上海市動物源性腸桿菌中tet(X4)流行率及其質粒的綜合監測仍然有限。本研究從上海地區652株食源性動物大腸桿菌中篩選出5株耐替加環素大腸桿菌，對其進行基因組測序和生物信息學分析發現，除tet(X4)外，p193k家族的其他成員在其他國家還具有其他至關重要的ARGs，這表明該高危質粒家族在各國廣泛流行。 研究材料與方法 1、實驗材料：從上海市的5個區的養殖場篩選得到652株大腸桿菌菌株，其中包括246株來自雞、304株來自豬和102株來自牛。 2.測序平臺：Illumina NovaSeq + Pacbio Sequel II 3.分析內容：藥敏實驗、質粒接合實驗、質粒穩定性實驗、細菌基因組完成圖測序、MLST分析、質粒復制子類型分析、質粒遺傳背景分析、系統發育樹構建等； 研究結果 上海地區tet（X4）陽性大腸桿菌的耐藥性及其他特征分析 本研究從2018-2021年，對來源于食用動物中分離得到的652株大腸桿菌進行了藥敏實驗，對其中的來源于健康豬的對替加環素具有耐藥性的菌株進行進一步研究。MLST分析顯示，這五株大腸桿菌被細分為四個不同的ST。 基于高通量測序，對四種大腸桿菌菌株的完整染色體和質粒進行了詳細表征（圖1B-C）。這四個tet（X4）陽性菌株均存在一個幾乎完全相似的攜帶tet（X4）的質粒，并且我們研究中的tet（X4）陽性質體的大小都接近193kb，因此縮寫為p193ktetX4。令人驚訝的是，除了tet（X4）外，四個p193k-tetX4還共同攜帶一些常見的ARGs，包括氯霉素（floR）、氨基糖苷類（aadA22）和林可酰胺（lnu（G）），以及p19Y2-tetX4和p20Y26-tet4中的特異性qnrS1。此外，最小的184kb p20Y2-tetX4在blaTEM-1B和qnrS1中不存在，插入序列（IS2和△ISCR2）和幾種假設的蛋白質（圖1B）。 圖1 分離得到的五株陽性豬源性大腸桿菌菌株具有四種tet（X4）信息圖 tet（X4）陽性質粒（pTetX4s）的全球流行率 截至2022年8月，共發現151個tet（X4）陽性質粒（pTetX4s）的完整基因組序列。這些質粒分布在橫跨四大洲的十個國家，并在中國大量傳播，只有24株來自其他國家，包括巴基斯坦、美國和土耳其（圖2A）。生成了一個具有九個顏色編碼簇的ML系統發育樹，以研究151個pTetX4s的進化關系（圖2B），發現來自不同來源、地理位置和細菌宿主的pTetX4的聚類成不同簇。 有趣的是，34個p193k-tetX4完全起源于中國（圖2C）。此外，這34種質粒不僅在大腸桿菌（61.76%）中發現，而且在克雷伯菌屬（17.65%）、腸桿菌屬（8.82%）、檸檬酸桿菌屬（5.88%）等中也發現（圖2B）。總體而言，這些結果表明p193k-tetX4具有宿主間轉移和時空傳播的能力，但僅在中國檢測到，占中國pTetX4的26.7%，這表明該質粒家族極有可能在中國流行，尤其是在廣東省（n=6）和廣西省（n=6）（圖2C）。 圖2 tet（X4）陽性質粒（pTetX4s）的全球分布 攜帶多種ARGs的p193k質粒家族的廣泛存在 為了進一步研究類似于p193k的質粒的流行，在NCBI nr數據庫中基于BLASTn，鑒定了154個質粒（與p19Y2-tetX4至少99%的同一性和70%的覆蓋率）。通過探索每個質粒的復制子類型、ARGs和起源（圖3），所有p193k都具有獨特的融合質粒，包括至少兩個拷貝的IncFIA（HI1）、IncHI1A和IncHI1B（R27），占p193k家族中總質粒復制子的44.81%（69/154）。在從23個國家獲得的154個p193k中，中國（n=54）、孟加拉國（n=22）和加拿大（n=13）占大多數。大腸桿菌屬（n=75）是最常見的細菌宿主，其次是沙門氏菌屬（n=59）和克雷伯菌屬（n=9）。 除了tet（X4）（n=34）外，這154個p193k還攜帶許多ARG，包括aph、sul、qnrS、flor、mph、fosA、lnu（G）等。還鑒定了至關重要的ARG，如粘菌素抗性基因mcr（n=12）、碳青霉烯抗性基因blaNDM（n=6）等（圖3）。這些ARG對幾種重要的抗菌藥物具有耐藥性，對總共16類抗菌藥物產生耐藥性。除了來源不明的14個p193k序列外，其余序列來自豬（n=39）、雞（n=10）、牛（n=10）。值得注意的是，p193k家族的主要來源是從人類中分離出來的，這表明它經常在動物和人類之間轉移，并對公眾健康構成重大威脅。 圖3 質粒復制子類型、ARGs和來源在全球154 p193k家族成員的質粒ML樹中的分布 p193k家族關鍵ARGs獨特的遺傳環境 作為193k-tet（X4）陽性質粒中最普遍的IncFIA（HI1）/HI1A/HI1B（R27）復制子類型，比較了其不同宿主、來源和地理區域質粒的線性遺傳結構（圖4A）。發現tet（X4）上有一個22kb的保守基因組區域。值得注意的是，從雞中收集的pSY3626_190k_tetX中tet（X4）的遺傳環境與人源性pE-T306-tetX4的遺傳環境高度相似（圖4A）。此外，一個豬克雷伯菌質粒pTKPN_3-186 k-tetX4也與大腸桿菌廢水質粒pHT1–1相似，表明p193k-tetX4已在動物、環境和人類之間傳播。 對mcr、blaNDM和blaOXA-9的遺傳環境和IS特征進行了廣泛的研究（圖4）。含有mcr-1的質粒主要來自中國和東南亞國家（包括馬來西亞和新加坡），來源（豬、雞、蔬菜和人類），以及細菌宿主（埃希氏菌屬、克雷伯菌屬和沙門氏菌屬）不同（圖4）。同時，除了人類和未知來源的blaOXA外，其余含有關鍵AMR基因的p193k具有不同的來源，表明高風險p193k可能在動物、環境、以及人類中廣泛傳播。 圖4p193k和其他pTetX4中tet（X4）的特殊遺傳背景分析圖 193kb tet（X4）陽性質粒和菌株基因組的系統發育分析 對來自203個菌株共計203193kb tet（X4）的完整陽性質粒（p193k-tetX4）或質粒相關序列，構建了ML系統發育樹（圖6A），分為4個聚類譜系（I-IV），表明其可能來源于中國的大腸桿菌菌株S752。譜系IV是最常見的聚類（85.22%），包括173個分離株。同時，譜系IV包括來自動物（n=143）、人類（n=18）和環境（n=9）的170個菌株。結果表明，p193k-tetX4已在不同的人類、動物甚至環境來源以及細菌物種之間廣泛傳播 更重要的是，對比例最大的大腸桿菌菌株進行了基因組水平的系統發育分析。生成了包含180個攜帶p193k-tetX4的大腸桿菌基因組序列的ML系統發育樹，聚類為六個譜系（圖第6B段），主要為第六譜系，占總數的82.22%。值得注意的是，來自不同來源的菌株被發現是緊密相連的，如圖6A-B所示，20Y26與豬品系HUN49密切相關，并聚集在同一譜系中。在這里，本研究中攜帶p193k-tetX4的四個大腸桿菌菌株聚集在ML系統發育樹的主要分支內。 圖5基于p193k-tetX4單拷貝核心SNPs的ML系統發育樹分析 研究結論 本研究在上海地區分離得到4種不同ST型的對替加環素耐藥的大腸桿菌，并發現了1個193kb的攜帶tet(X4)的質粒。pTetX4的全球流行病學揭示了p193k-tetX4質粒復制子類型的國際分布、廣泛的宿主范圍和多樣性。然后，鑒定了來自NCBI的p193k家族的154個成員，對質粒復制子類型和ARGs的研究表明，p193k家族是ARGs重要的庫。許多ARG的共存表明了廣泛使用的、至關重要的抗生素所施加的共同選擇的壓力。此外，系統發育研究表明，p193k-tetX4可以在不同的細菌種類和來源之間轉運。因此，在許多人類-動物-環境光譜和細菌物種中，對高危質粒如p193k進行持續的基于健康的監測是至關重要的。 如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：021-80118168-8617）！ 文章索引：Li M., Zhang HR., Zhang WG., et al. One global disseminated 193 kb high-risk hybrid plasmid harboring tet(X4), mcr or blaNDM threatening public health [J].Sci Total Environ. 2023.doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.162807.
