2023-08-18
Microbiome 影響因子：15.5 廣東省科學院生態環境與土壤研究所在Microbiome發表題為“Characterization of diazotrophic root endophytes in Chinese silvergrass (Miscanthus sinensis)”文章，本文作者利用高通量測序、DNA-SIP、宏基因組binning分析、純菌分離培養和盆栽實驗證明尾礦生長的先鋒植物芒草可以特異性地招募一些固氮內生菌，提高其對極端環境的生態適應性。 本研究的測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。 研究背景 尾礦污染是一個全球性的環境挑戰，植物修復與傳統的物理和化學清理方法相比，具有破壞性小，成本效益高等好處。而養分的限制，特別是氮素的缺乏，會阻礙植物的生長，影響尾礦的植物修復。芒草，由于其具有較高的金屬積累潛力和生物質產量，故非常適合用于礦山尾礦的植物修復。此外，芒草根系相關微生物群可能有助于植物抗金屬、養分獲取和促進植物生長。因此，本研究作者選擇芒草作為模式先鋒植物，開展以下研究。 研究方法 樣品采集于中國西南地區的4個尾礦，每個采樣點采集5個芒草根系樣本（共采集20個），對照根系樣本從附近污染較輕的地點采集。通過 DNA穩定同位素探測（DNA-SIP）結合宏基因組binning分析，鑒定推測的重氮營養內生菌并預測其代謝潛力。 實驗對象：芒草根系 測序區域：16S V4+宏基因組 測序方法：Illumina NovaSeq 實驗設計概述圖 研究結果 1.先鋒植物根內生菌群落及關鍵微生物分析 對尾礦庫（HC）和周邊低污染產地（LC）采集先鋒植物進行分析。微生物多樣性分析表明，與LC相比，HC樣品根內微生物的alpha多樣性（如Chao1、Observed和Shannon）較低。同時因場地的不同導致細菌群落組成有顯著差異。在微生物的屬水平上分析表明，根瘤菌屬（Rhizobium）是HC中優勢屬，厭氧菌屬（Anaeromyxobacter）是LC中優勢屬。根據微生物關聯網絡分析，進一步表明HC和LC的關鍵微生物類群存在顯著不同。 圖1 先鋒植物根內生菌群落及關鍵微生物分析 A: alpha多樣性分析；B: beta多樣性分析；C: 微生物屬水平差異；D、E、F、G: 微生物關聯網絡分析 2.DNA-SIP鑒定先鋒植物根內生固氮菌 用無氮的Jensen培養基構建SIP微宇宙培養體系。經過超高速離心后，檢測各分層中的nifH基因豐度，發現培養第28天后，15N2處理中nifH基因豐度最高層向重層發生了明顯偏移，說明內生菌已將大量的15N同化?；谏鲜鯯IP分層結果，對培養28和35天的15N2處理的重層及14N2處理的輕層進行16S rRNA基因高通量測序，結果顯示Exiguobacterium、Pseudomonas和Rhizobium在15N2標記處理的重層DNA部分中占主導地位，這可能是潛在的固氮內生菌。 圖2 DNA-SIP鑒定先鋒植物根內生固氮菌 A: 微宇宙培養21、28和35天后，14N2和15N2處理的CsCl梯度中nifH基因的相對豐度。分析了整個梯度分層中，每個分層中的nifH基因的豐度都轉換為總的nifH基因拷貝數的相對豐度；B: SIP實驗中，15N2處理的重層及14N2處理的輕層中微生物群落組成的比較 3.固氮內生微生物的代謝途徑 為進一步研究先鋒植物內生固氮功能微生物的相關代謝途徑，對15N2處理的重層DNA進行宏基因組測序分析。利用宏基因組分箱技術拼接基因組草圖，得到了4個高質量基因組草圖，系統發育樹將其分類為Exiguobacterium、Pseudomonas、Rhizobium和Microbacterium。其中bin1、bin2和bin3是由DNA-SIP實驗鑒定的相關內生固氮菌。在這三個MAGs中都發現了固氮酶基因，以及與植物定殖、重金屬抗性和植物促生相關的基因。 圖3 固氮內生微生物的代謝途徑 A: 固氮內生菌基因組草圖和B:功能基因分析 4.內生固氮菌的分離及其植物促生能力的驗證 從芒草根內分離出兩株固氮內生菌，分別是Pseudomonas sp. Y-5和Rhizobium sp. G-14。通過盆栽實驗評估了這些細菌促進另一種尾礦先鋒植物B. pilosa L.的生長能力。接菌處理組相比對照顯著提高了植物莖的鮮重。此外，顯著增加根/莖氮含量。為驗證生物固氮，進一步對B. pilosa L.莖和根中轉錄的nifH基因進行了定量，相比對照組接種組顯著增加了植物根和莖的轉錄nifH基因的拷貝量。 圖4 內生固氮菌的分離及其植物促生能力的驗證 A: 不同處理的B. pilosa L.幼苗圖片；B: 接種分離菌株對鮮重；C: 根和莖氮含量；D:15 N豐度的影響；E: 根和莖中nifH轉錄水平在不同處理之間的比較 5.分離內的生固氮菌對植物的定殖效果 為驗證分離得到的內生固氮菌的定殖效果，對根際和根內的微生物群落特征進行了研究。結果表明接種處理顯著增加了接種固氮菌在根際和根內的豐度。qPCR試驗進一步證實了處理組相比對照顯著增加了根際和根內Pseudomonas和Rhizobium的豐度。 圖5 盆栽根際和根內微生物群落組成 研究結論 先鋒植物可以成功地在尾礦上定植，顯示出尾礦植物修復的潛力。本研究證明了先鋒植物芒草可以招募一些固氮內生菌（Pseudomonas、Rhizobium和Exiguobacterium）作為關鍵物種，揭示了其具有固氮、抗重金屬、植物促生的潛力。同時，從中國芒草中分離出的兩個固氮內生菌Rhizobiumsp. G-14和Pseudomonas sp. Y-5也被證明固氮及促進植物生長的作用，提高植物在極端環境的生態適應性。 文章索引：Li, Y., Yang, R., H?ggblom, M.M. et al. Characterization of diazotrophic root endophytes in Chinese silvergrass (Miscanthus sinensis). Microbiome 10, 186 (2022). https://doi.org/10.1186/s40168-022-01379-9
