2023-07-18
《Journal of Hazardous Materials》 影響因子：13.6
文章題目：Triphenyl phosphate induced reproductive toxicity through the JNK signaling pathway in Caenorhabditis elegans 技術手段：RNA-Seq 上海大學在《Journal of Hazardous Materials》上發表了磷酸三苯酯 (TPHP) 通過JNK信號通路誘導秀麗隱桿線蟲生殖毒性的研究成果。本研究的轉錄組測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
一、研究背景
由于溴化阻燃劑(BFRs)的逐步限制，有機磷阻燃劑(OPFRs)的生產和消費量急劇增加。磷酸三苯酯(TPHP)是應用最廣泛的芳基OPFRs之一，已被用于玩具、紡織品、家具、汽車和電子產品中。TPHP容易從消費品遷移到環境中。據報道，TPHP已在水、土壤、粉塵、人體等中檢測到。根據已發表的毒理學研究，TPHP可誘導神經毒性、發育毒性、代謝紊亂、內分泌紊亂和生殖毒性。因此必須考慮與TPHP暴露相關的毒性問題。然而，TPHP暴露導致生殖毒性的分子機制有待進一步探索。 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路調控分化、增殖、凋亡、中胚層分化、精子成熟等參與生殖過程。MAPKs可分為以下3個亞家族:細胞外信號調節激酶(ERKs)、c-Jun N-末端激酶(JNKs)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38s)。值得注意的是，JNK信號通路主要參與生殖行為的多種功能。然而，TPHP暴露誘導的生物生殖異常及其分子機制，特別是JNK信號通路是否發揮重要的調控作用尚不清楚。因此，有必要深入研究TPHP對生殖的影響，為芳基OPFRs的生產和使用提供生物毒性評價支持。
二、技術路線
三、研究結果
1.秀麗隱桿線蟲中TPHP的生物積累 利用LC-MS/MS分析了暴露于不同濃度TPHP(0、0.1、1、10、100、500 μg/L)的秀麗隱桿線蟲體內TPHP的暴露濃度和生物積累因子(BAF)。1、10、100和500 μg/L TPHP暴露組秀麗隱桿線蟲體內TPHP濃度呈濃度依賴性增加(表1)，TPHP的log10BAF值為1.23-2.73(表1)。 表1暴露后秀麗隱桿線蟲中TPHP的濃度和log10BAF的測量 2.TPHP減少秀麗隱桿線蟲的壽命 壽命和致死效應實驗的結果表明，對照組的平均壽命為18.2±0.85天。在1,10,100和500μg/L TPHP暴露后，平均壽命減少了1.65%，12.47%，13.3%，25.22% (p < 0.01)(圖1)。這些結果表明，暴露于不同水平的TPHP會以濃度依賴的方式縮短秀麗隱桿線蟲的壽命。因此，本研究在此基礎上進一步探究TPHP暴露誘導秀麗隱桿線蟲的生殖毒性。 圖1 TPHP暴露后秀麗隱桿線蟲的壽命 3.TPHP誘導生殖細胞周期阻滯 細胞周期阻滯測試表明，秀麗隱桿線蟲生殖腺細胞分為有絲分裂區、過渡區和減數分裂前期(圖2a-b)。有絲分裂區位于秀麗隱桿線蟲性腺的遠端；過渡區細胞呈新月形；減數分裂前期位于生殖腺的近端。秀麗隱桿線蟲的所有減數分裂生殖細胞在L4期發育為精子，在成蟲期發育為初級卵母細胞。本研究中，TPHP (1 μg/L, 500 μg/L)暴露后，有絲分裂區(62.5%和59.0%)、過渡區(69.8%和71.1%)和減數分裂前期(63.1%和61.5%)的細胞數量顯著減少(p < 0.01)(圖2c)。這表明TPHP可能導致秀麗隱桿線蟲性腺功能低下。 圖2 TPHP誘導秀麗隱桿線蟲的生殖系表型 4.TPHP暴露后生殖毒性評價 AO染色用于觀察和鑒定性腺凋亡細胞，在秀麗隱桿線蟲性腺臂的減數分裂區觀察到黃綠色斑點（圖3a–b）。TPHP暴露誘導了線蟲性腺細胞凋亡的濃度依賴性增加(圖3c)。繼續培養至產卵高峰期，暴露于1、10、100和500 μg/L的TPHP后，子宮內胚胎數量分別減少了14.2%、18.2%、18.1%和21.8%(圖3d-e)。即使在1 μg/L TPHP暴露組，子宮內胚胎數量也顯著減少(p < 0.01)。此外，暴露于1、10、100和500 μg/L的TPHP后，后代數量分別減少了10.66%、13.94%、15.25%和17.39%(圖3f)，與子宮實驗中胚胎數量的結果相似。本研究證實，TPHP暴露影響秀麗隱桿線蟲的生殖能力，包括性腺細胞凋亡數量增加，子宮內發育胚胎數量減少和后代數量減少。 圖3 TPHP暴露誘導秀麗隱桿線蟲的生殖效應 5.TPHP暴露后轉錄組測序分析 轉錄組測序結果顯示。TPHP各組3個重復樣本的樣本相關系數均接近于1，說明轉錄組數據的重復性和可靠性較高(圖4a)。TPHP_L組中顯著上調基因1588個，顯著下調基因1802個，TPHP_H組顯著上調基因2427個，顯著下調基因2429個。表明高、低水平的TPHP暴露均可引起秀麗隱桿線蟲基因表達的顯著變化(圖4b)。兩個比較組的共有差異基因為1455個，表明秀麗隱桿線蟲在高、低水平TPHP暴露后，差異基因具有高度一致性(圖4c)。 KEGG富集分析結果顯示，MAPK信號通路在兩個比較組中均顯著富集。(圖4d)。根據轉錄組結果，對MAPK信號通路中所有顯著的差異基因（DEGs）進行排序。其中，JNK是MAPK家族的重要成員，參與動物生殖調控。值得注意的是，kgb-1、kgb-2、vhp-1、mkk-4、dlk-1和egl-15基因的表達均發生了顯著變化。因此，TPHP暴露可能通過JNK信號通路誘導秀麗隱桿線蟲的生殖毒性。 圖4 TPHP誘導秀麗隱桿線蟲的轉錄組分析 6.秀麗隱桿線蟲JNK信號通路的測定 對JNK信號通路的關鍵基因進一步分析顯示，在1μg/L水平上，TPHP暴露下調了kgb-2和vhp-1基因的表達，而kgb-1基因表達上調。egl-15、dlk-1、mkk-4、kgb-2以及vhp-1基因在500μg/L TPHP暴露組中下調（圖5a）。qRT-PCR結果顯示，vhp-1和kgb-2表達水平未有顯著差異。500 μg/L TPHP暴露組的qRT-PCR結果與轉錄組相似，即kgb-1上調，egl-15、dlk-1、mkk-4和vhp-1下調(圖5b)。轉錄組與qRT-PCR數據相關性分析的R2為0.7943，說明轉錄組與qRT-PCR數據具有較高的一致性(圖5c)。通過轉錄組和qRT-PCR綜合分析，500 μg/L TPHP暴露后，kgb-1表達升高，而egl-15、dlk-1、mkk-4和vhp-1表達降低。 圖5 1和500 μg/L TPHP暴露對秀麗隱桿線蟲JNK信號通路相關基因mRNA轉錄水平的影響 7.JNK信號通路中基因功能分析 突變株egl-15 (n484)、mkk-4 (ok1545)、kgb-2 (gk361)和vhp-1 (sa366)的性腺細胞凋亡數分別是野生型的1.59倍、0.82倍、1.62倍和1.43倍；1 μg/L TPHP作用下，性腺細胞凋亡數分別是野生型的1.39倍、0.74倍、1.40倍和1.30倍。500μg/L TPHP作用下，與相同暴露條件下的野生型相比，只有kgb-2（gk361）突變株表現出1.17倍的顯著性增加（p<0.01），表明kgb-2基因敲除比暴露于500μg/L TPHP更嚴重，而敲除其他基因的效果相當于500μg/L TPHP的暴露效果（圖6a）。本研究證實，egl-15、dlk-1、kgb-1、kgb-2和vhp-1基因突變導致線蟲性腺細胞凋亡數量增加，而kgb-2可能在生殖細胞凋亡中起更重要的作用。 此外，與野生型相比，mkk-4 (ok1545)、kgb-2 (gk361)和vhp-1 (sa366)突變株在未暴露對照組的子宮胚胎數量分別減少0.25、0.29和0.32倍，1 μg/L TPHP暴露組的子宮胚胎數量分別減少0.24、0.37和0.33倍，500 μg/L TPHP暴露組的子宮胚胎數量分別減少0.31、0.34和0.38倍(圖6b)。與未暴露的野生型相比，kgb-2 (gk361)和vhp-1 (sa366)突變株的單蟲總子代數分別減少了0.33倍和0.28倍，而在1 μg/L TPHP暴露后分別減少了0.34倍和0.31倍，在500 μg/L TPHP暴露后分別減少了0.39倍和0.41倍(圖6c)。因此，TPHP暴露后JNK信號通路中kgb-2和vhp-1基因缺失會導致生殖性能降低。 圖6 JNK信號通路相關基因在秀麗隱桿線蟲生殖效應中的作用
四、結 論
本研究表明，暴露于TPHP會影響秀麗隱桿線蟲的生殖能力，包括增加性腺細胞凋亡的數量，減少子宮內發育胚胎的數量以及減少后代的數量。此外，通過轉錄組分析、qRT-PCR實驗和突變體驗證方法證實了TPHP暴露會通過JNK信號通路誘導秀麗隱桿線蟲的生殖毒性。其中，JNK信號通路中kgb-2和vhp-1基因的缺失在秀麗隱桿線蟲暴露于TPHP后生殖性能下降中起著至關重要的作用。這些發現有助于深入了解芳基OPFRs在無脊椎動物體內的生物積累性，對芳基OPFRs的毒性評價具有重要意義，并可為尋找毒性更小、危害更小的阻燃劑提供基礎的毒性和毒理機制數據。
原文索引： Shi C, Wang C, Zeng L, Peng Y, Li Y, Hao H, Zheng Y, Chen C, Chen H, Zhang J, Xiang M, Huang Y, Li H. Triphenyl phosphate induced reproductive toxicity through the JNK signaling pathway in Caenorhabditis elegans. J Hazard Mater. 2023 Mar 15;446:130643. doi: 10.1016/j.jhazmat.2022.130643.
