2023-07-11
《Experimental & Molecular Medicine》
影響因子：12.8
上海交通大學在國際著名雜志《Experimental & Molecular Medicine》發表了一種治療阿爾茨海默癥的新策略，利用 TRPV1調節神經元脂質代謝和自噬穩態來減輕 ApoE4 等位基因影響。本研究中脂質代謝以及轉錄組測序部分分析工作均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
技術路線
研究背景
在ε2 -ε4多態性等位基因中，載脂蛋白E 基因的ε4等位基因是遲發性阿爾茨海默病(LOAD)的最強的遺傳風險因子，ApoE4基因拷貝數增加，阿爾茨海默病患病風險也將隨之增加。多項研究發現，APOE4與β-淀粉樣蛋白沉積增加、tau蛋白過度磷酸化和聚集、認知能力下降加速相關。然而，APOE4介導這些效應的機制還不完全清楚。因此，闡明APOE4誘發阿爾茲海默病的分子機制和細胞途徑，對預防和治愈阿爾茲海默病十分重要。
研究材料與方法
1.實驗材料
轉基因小鼠ApoE3或ApoE4與TRPV1?/?小鼠雜交后代 2.測序平臺 Agilent 1290 Infinity LC、Illumina NovaSeq 5000 3.分析方法 LC?MS/MS、RNA-seq、WB、IF、ICC、FC等
研究結果
1.ApoE4等位基因導致神經元和小膠質細胞脂質代謝功能障礙
全基因組關聯研究表明，脂質代謝紊亂與許多遲發性神經退行性疾病有關，例如阿爾茨海默癥。研究通過免疫共熒光染色表明攜帶ApoE4等位基因的AD患者比健康者在小膠質細胞和神經元中積累了更多的脂滴（圖1a，b），但是星形膠質細胞中的脂滴積累沒有差異。質譜定量結果顯示ApoE4 小鼠大腦中磷酸膽堿（PC） 顯著下調（圖1f），打破了細胞內脂質穩態。轉錄組測序共篩選到76個差異基因（圖1g，h），顯著富集在炎癥反應以及多種能量代謝等通路上（圖1j），表明 ApoE4 小鼠大腦中的能量代謝失調。此外WB結果中ApoE4 小鼠的 Akt/mTOR 和p-IRS1的蛋白水平低于 ApoE3 小鼠（圖 1k，l），表明 ApoE4 導致能量代謝功能障礙和胰島素抵抗。進一步研究發現 ApoE3 HFD 與ApoE4 HFD 小鼠相比，其神經元和小膠質細胞中脂滴顯著積累（圖 1m，n）。 圖1 ApoE4等位基因導致神經元和小膠質細胞脂質代謝功能障礙 2.TRPV1 激活調節 ApoE4 誘導的小膠質細胞脂滴積累和免疫功能障礙 為了研究 ApoE4 對小鼠大腦中免疫細胞的影響，使用流式細胞術定量 ApoE3 和 ApoE4 小鼠大腦中的免疫細胞，結果顯示，ApoE4 小鼠大腦中的 CD45lowCD11b+ 小膠質細胞顯著增加（圖 2a-e），外周免疫細胞、CD45highCD11b+ 單核細胞、CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞也顯著上調。轉錄組差異分析及富集分析結果表明ApoE4 小鼠大腦中 TRPV1 激活導致了膠質細胞中的脂質積累（圖 2f-g）。此外使用辣椒素對 TRPV1 進行激活可減弱 ApoE4 BV2 細胞中 MMP 去極化和 ROS 產生（圖 2n-p）。 圖2 TRPV1激活逆轉ApoE4誘導的小膠質脂滴積聚和免疫功能障礙 3.TRPV1 激活逆轉 ApoE4 誘導的神經元代謝損傷和脂滴積累 PA 是一種飽和長鏈脂肪酸，可用于模擬體內 HFD 暴露，免疫熒光結果表明 TRPV1 激動劑通過誘導自噬促進神經元脂滴清除（圖 3a-c），此外 TRPV1 激活挽救了脂質代謝過程中 ApoE4 誘導的神經元自噬損傷（圖 3f-i）。與 ApoE4 細胞相比，辣椒素處理顯著增加了 ApoE4 + 辣椒素原代神經元的基礎呼吸和最大呼吸（圖 3j）。MAP2+神經元的免疫熒光顯示，ApoE4+辣椒素神經元的神經突長度、分支數量和面積顯著長于ApoE4神經元（圖3k）。 圖3 TRPV1激活逆轉apoe4誘導的神經元自噬損傷和脂滴積累 4.TRPV1 激活可挽救 ApoE4 HFD 喂養小鼠的記憶障礙和神經元損失 通過Y迷宮測試分析小鼠的空間工作記憶功能，評估結果表明，經辣椒素處理的 ApoE4 HFD 小鼠學習和記憶能力有所改善（圖4a-e）。通過磷酸化 tau (AT8) 的免疫染色顯示與 ApoE3 HFD 小鼠相比，ApoE4 HFD 小鼠海馬體的表達顯著上調，又通過對海馬體中磷酸化 tau 免疫染色，結果表明辣椒素對 TRPV1 的激活可改善 ApoE4 HFD 誘導的 tau 病理學（圖 4h，i）。 圖4 TRPV1激活可挽救 ApoE4 HFD 喂養小鼠的記憶障礙和神經元損失 5.激活TRPV1可減弱ApoE4 HFD小鼠的小膠質瘤表型 作為大腦駐留的免疫細胞，小膠質細胞代表著衰老小鼠大腦中脂滴積累的促炎和吞噬功能損傷狀態，于是本研究分析了與小膠質細胞功能相關的基因轉錄組譜，結果顯示與 ApoE3 HFD 小鼠相比，ApoE4 HFD 小鼠大腦中促炎基因表達顯著上調，正常細胞功能基因的表達顯著下調（圖5a，b）。對小膠質細胞形態分析顯示，ApoE4 HFD 小鼠的小膠質細胞分支長度和 Iba-1+ 細胞面積顯著增加， ApoE4 HFD 小鼠中小膠質細胞終點連接的數量也呈現增長趨勢（圖 5c、d）。為了確定 TRPV1 激活是否可以挽救 ApoE4 誘導的小膠質細胞吞噬活性受損，進行了小膠質細胞吞噬測定，測定顯示TRPV1激活挽救了ApoE4小膠質細胞誘導的神經元生長受損（圖5g，h）。 圖5 TRPV1激活可減弱ApoE4 HFD小鼠的小膠質細胞增生和小膠質細胞脂質積累 6.TRPV1 激活減弱 ApoE4 HFD 小鼠突觸的小膠質細胞吞噬作用 為了研究 TRPV1 對神經元突觸的影響，使用突觸后標記 PSD95 進行染色，PSD95和Iba-1雙重染色顯示，與ApoE4 HFD小鼠相比，TRPV1激活顯著下調ApoE4 HFD +辣椒素小鼠中小膠質細胞對突觸的吞噬，另外NeuN和B2M雙重染色顯示神經元 B2M 表達增加，表明 ApoE4 HFD 小鼠中 MHC-I 通路上調。，TRPV1 激活顯著降低了 ApoE4 HFD + 辣椒素小鼠的神經元 B2M 表達（圖6h，i）。 圖6 TRPV1激活可減弱ApoE4 HFD小鼠突觸的小膠質吞噬作用 7.TRPV1 基因缺失加劇了 ApoE4 小鼠的識別障礙和 tau 病理學 為了進一步研究TRPV1對神經元脂質代謝功能障礙的影響，敲除了ApoE3和ApoE4小鼠的TRPV1基因，再通過細胞免疫染色和轉錄組分析，結果顯示TRPV1 基因缺失通過上調 ApoE4 小鼠神經元 MHC-I 表達，導致小膠質細胞吞噬更多突觸（圖 7k，l）。另外磷酸化 tau 免疫熒光顯示，與 TRPV1?/?-ApoE3 小鼠相比，TRPV1?/?-ApoE4 小鼠的海馬體中的表達顯著上調（圖 8a-d）。 圖7 TRPV1基因缺陷加重了ApoE4小鼠的識別損傷和神經元脂滴積累 圖8 TRPV1基因缺陷加重了ApoE4誘導tau病理
小 結
本研究發現，用辣椒素激活TRPV1可逆轉ApoE4誘導的小膠質細胞免疫功能障礙和神經元自噬損傷，另外TRPV1基因缺失加重了ApoE4小鼠的識別記憶障礙和tau病理。總而言之，TRPV1調節脂質代謝可減輕ApoE4等位基因的影響，這可能是一種潛在的阿爾茨海默癥治療方法。
