2023-07-10
《Virus Research》
影響因子：5.0
近日，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院在病毒學(xué)領(lǐng)域的《Virus Research》發(fā)表新研究成果！本研究對新發(fā)現(xiàn)的噬菌體vB_EcoP_E212進(jìn)行了鑒定，并對其基因組進(jìn)行了注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種噬菌體只感染產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌K88菌株。該噬菌體缺乏致病毒力因子同源物或者抗菌素耐藥基因，但其具有溶源性相關(guān)基因。通過核苷酸比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，將該噬菌體定位于Lederbergvirus屬。
本研究的噬菌體基因組測序分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
在新生仔豬和早期斷奶仔豬中由產(chǎn)毒素大腸桿菌（ETEC）引起的腹瀉病是比較常見的，其中E.coli K88或F18是最常見的感染菌株。抗生素可以很有效地用于治療ETEC感染，然而抗生素濫用會引起藥物殘留和抗菌素耐藥性。在全球范圍內(nèi)，抗菌素耐藥性的上升對人類、動物和環(huán)境健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，盡快建立新的策略來管理、抑制和根除細(xì)菌感染是至關(guān)重要的。噬菌體被認(rèn)為是有價值的替代抗菌解決方案，噬菌體治療與傳統(tǒng)的抗菌素治療相比具有許多顯著的優(yōu)勢，如高殺菌活性、低固有毒性、低成本和引入耐藥性的風(fēng)險低。在本研究中，從農(nóng)場污水中分離并鑒定了一種新的噬菌體，對其生物學(xué)特性進(jìn)行了評價、基因組序列進(jìn)行了完整測序和進(jìn)行了比較基因組分析，這些結(jié)果可以用來確定其預(yù)防和控制ETEC K88的潛力。
研究材料與方法
1.實驗材料：農(nóng)場污水中分離純化的噬菌體vB_EcoP_E212
2.測序平臺：Illumina Novaseq
3.分析內(nèi)容：噬菌體基因組測序、全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、easyfig比較分析等。
研究結(jié)果
噬菌體的分離、形態(tài)及宿主范圍鑒定
從污水中鑒定出一種針對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 (CVCC 83,902)的噬菌體，命名為vB_EcoP_E212(簡稱E212)。E212具有一個二十面體頭部(50±3 nm)與尾部(8±2 nm)相連的特征，根據(jù)這些結(jié)構(gòu)特征，E212被歸類為Caudoviricetes的一員。使用E212對22株細(xì)菌的感染性進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)其宿主范圍非常窄，僅抑制宿主細(xì)菌。
圖1 噬菌體電鏡結(jié)果
噬菌體生物學(xué)鑒定
當(dāng)噬菌體E212暴露于氯仿時，其保持穩(wěn)定。在所有檢測的MOI中，最高滴度的MOI為0.001。在溫度范圍從20℃到60℃的熱穩(wěn)定性測試中，噬菌體E212活性保持在高水平。較高的溫度對噬菌體E212的存活能力有影響，在70℃孵育40 min后，噬菌體E212的滴度下降。當(dāng)溫度升至80℃孵育40 min和80 min時，噬菌體E212的滴度迅速下降。噬菌體E212在pH3 ~ pH12范圍內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定。在pH<3或pH>12條件下孵育1 h后，沒有噬菌體顆粒存活。
圖2 E212生物學(xué)鑒定結(jié)果
一步曲線及噬菌體體外感染實驗
一步曲線顯示，噬菌體E212潛伏期較短，約為20 min。潛伏期結(jié)束后，有一個爆發(fā)期，持續(xù)約60 min，從感染后20 ~ 80 min，然后轉(zhuǎn)入平臺期。在37℃、MOI=0.001條件下，通過測定宿主細(xì)菌生長過程中宿主細(xì)菌的存活量、噬菌體滴度和液體培養(yǎng)基的光密度來評價噬菌體E212的裂解活性。結(jié)果表明，噬菌體E212能在6 h內(nèi)減少產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88的數(shù)量；與初始時間點相比，宿主細(xì)菌存活量降低了1個對數(shù)，噬菌體E212滴度提高了4個對數(shù)。
噬菌體E212基因組的表征
E212是線性雙鏈DNA基因組，長度為38,252 bp，GC含量為46.98%。基因預(yù)測得到53個ORF，其中31個具有功能名稱。所有ORF占全基因組的86.2%，平均ORF長度為622.19 bp，未預(yù)測tRNA基因。E212中的大部分ORF是由4個GUG密碼子和2個UUG密碼子以及AUG密碼子為起始密碼子。三個終止密碼子分布不同：分別為UGA、UAA和UAG。在噬菌體結(jié)構(gòu)模塊中，ORF 29、30和31分別被鑒定為預(yù)測的門蛋白、支架蛋白和衣殼蛋白，這些蛋白質(zhì)聚集在一起形成原衣殼；ORF45與腸桿菌噬菌體HK620具有較高的氨基酸序列相似性；DNA馬達(dá)的N端ATPase和核酸酶的C端負(fù)責(zé)前體結(jié)合、DNA易位和DNA切割，構(gòu)成了大亞基(ORF28)；小端酶亞基((ORF27)具有DNA結(jié)合活性，并參與識別其自身的DNA；ORF 46被預(yù)測為整合酶，具有99%的序列同一性；鑒定出3個ORF為宿主裂解模塊，分別為開孔模塊((ORF21)、裂解模塊(ORF22)和RZ蛋白(ORF23)。
圖3 E212基因組圈圖
系統(tǒng)發(fā)育和比較基因組分析
對已發(fā)表的18個噬菌體和E212的全基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以確定Lederbergvirus屬內(nèi)兩種噬菌體的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體phiv205-1、噬菌體JEP4和噬菌體Sf101與噬菌體E212的親緣關(guān)系更為密切。尾型dsDNA噬菌體的DNA包裝方法分為6個大類和17個亞類。在E212基因組中，未發(fā)現(xiàn)毒力因子同源物或抗生素耐藥基因。然而，溶源基因存在于所有Lederbergvirus噬菌體中，包括E212，因此E212不適合用于治療。雖然噬菌體是有價值的替代抗菌藥物，但并非所有噬菌體都可以用作治療劑，含有抗生素耐藥性、毒力和溶源基因的噬菌體基因組序列由于安全考慮是不允許的。
圖4 系統(tǒng)發(fā)育分析
在Lederbergvirus屬噬菌體中，E212和Enterobacteria噬菌體Sf101有20個保守蛋白，同源性為91.87%，包括門蛋白、支架、衣殼、整合酶、DNA甲基化酶、DNA結(jié)合蛋白、O蛋白、、裂解蛋白、頭部組裝蛋白、注射蛋白、尾部刺突蛋白和衣殼蛋白等。
圖5 噬菌體easyfig比較分析
結(jié) 論
本研究對vB_EcoP_E212的全基因組序列進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)其是一種溫帶噬菌體，具有38,252 bp的線性雙鏈DNA，GC含量為46.98%。根據(jù)基因組分析和形態(tài)特征，E212屬于一個新屬。雖然噬菌體是替代抗生素的理想候選體，但并非所有噬菌體都可以考慮采用這種方法，攜帶溶菌原、抗生素和毒力基因的噬菌體不應(yīng)用作生物防治劑。本研究的結(jié)果豐富了人們對噬菌體及其多樣性的認(rèn)識。
如需進(jìn)一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：021-80118168-8617）！
文章索引：Wei B, Cong C, Zheng L, et al. Isolation, characterization and whole genome analysis of the novel genus Lederbergvirus, phage vB_EcoP_E212 infecting enterotoxigenic Escherichia coli K88[J]. Virus Research, 2023, 331: 199125.
