2023-06-26
《Microbiome》
影響因子：16.837
近日，西北農林科技大學在微生物領域的《Microbiome》發表新研究成果！本研究發現益生菌能增強宿主對病原體感染的抵抗力主要取決于一種厭氧的索氏鯨桿菌產生的維生素B12的功能。此外，維生素B12作為一種腸道微生物調節劑，表現出加強腸道微生物群和腸道屏障緊密連接和相互作用的能力，從而提高宿主對病原體感染的抗性。
研究背景
現在抗生素是治療病原體感染的常用方法，但長期使用可能導致細菌耐藥性以及其他健康風險。益生菌可通過改善屏障功能、免疫調節、代謝功能和抑制潛在病原體四個機制發揮作用。此外，益生菌的存在也可以誘重塑腸道原生微生物群落。本研究以枯草芽孢桿菌和斑馬魚分別作為益生菌和動物模型，描述了益生菌調節斑馬魚腸道共生菌對宿主抵抗病原體感染的作用。
研究材料與方法
1.實驗材料 B. velezensis strain1704-Y 2.測序平臺 Illumina + PacBio 3.分析內容 細菌基因組完成圖測序、16S多樣性測序、PLS-PM分析等。
研究結果
1. 益生菌對嗜水氣單胞菌感染的保護作用取決于腸道微生物群 從斑馬魚腸道中分離出一株細菌1704-Y，經形態學觀察和gyrB基因系統發育樹鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，并通過溶血和抗生素敏感性試驗證明其對斑馬魚具有潛在的安全使用價值。同時，根據之前的研究，發現與抗生素混合的飼料消除了口服補充BV1704-Y的保護作用，從而表明腸道微生物群在保護斑馬魚免受嗜水氣單胞菌感染中發揮了關鍵作用。 圖1 1704-Y對斑馬魚預防致病性感染的影響 2. 索氏鯨桿菌對抵抗對嗜水氣單胞菌感染起到重要作用 為了確定腸道菌群如何影響BV1704-Y誘導的保護作用，首先采用16S rRNA多樣性測序方法比較研究口服給藥前后腸道菌群組成。α-多樣性結果表明，有無BV1704-Y的飼料間的細菌豐富度和多樣性沒有明顯差異。但主坐標分析（PCoA）顯示，BV1704- Y喂養的斑馬魚與對照組的細菌群落明顯不同。此外，腸道微生物群在門和屬水平上的組成也顯示了不同類群間腸道微生物群的差異，其中鯨桿菌是核心微生物中相對豐度最高的屬。 索氏鯨桿菌CS2105-BJ為桿狀細胞、中央腫脹、革蘭氏染色陰性和微耐氣性。在感染實驗中，CS2105-BJ組喂食的斑馬魚在感染后的存活率明顯高于對照組，且飼料中含CS2105-BJ顯著增加了斑馬魚腸道的類細菌負荷，并顯著降低了感染后10天魚腸道、肝臟和腎臟的嗜水氣單胞菌。總的來說，這些數據表明斑馬魚腸道中的索氏鯨桿菌對保護斑馬魚免受細菌感染做出了重大貢獻。 圖2 索氏鯨桿菌對抵抗嗜水氣單胞菌感染起到重要作用 3. 索氏鯨桿菌的全基因組注釋分析 索氏鯨桿菌CS2105-BJ包含一條染色體（1,904,440bp）和六個質粒（質粒1：704,842bp；質粒2：181,744bp；質粒3：128,183bp；質粒4：40,685bp；質粒5：9,413 bp；質粒6：4,104bp）平均GC含量為29.15%。共預測了2,732個蛋白編碼基因，其中2,371個（86.7%）基因注釋為功能基因，361個（13.3%）基因注釋為假設基因。在索氏鯨桿菌CS2105-BJ基因組中未發現毒力因子。此外，COG注釋結果顯示，CS2105-BJ基因組具有一組完整的維生素B12從頭合成所需的基因，也稱為氰鈷胺素。 眾所周知，B12可以為人類和動物的健康提供多種有益的功能，如保護腸道免受胃潰瘍的侵襲，調節腸道微生物生態，以及刺激免疫反應。此外，最近的一些數據表明，B12能夠有助于宿主防御致病性感染。因此，推測提高斑馬魚對嗜水氣單胞菌的抵抗力與CS2105-BJ基因組上的B12生物合成有關。B12的產量隨著體外細菌的增殖而增加，此外口服補充索氏鯨桿CS2105-BJ顯著提高了斑馬魚腸道中的B12水平。同時發現腸道微生物產生的維生素B12在保護宿主免受嗜水氣單胞菌感染中起著關鍵作用。 圖3 基因組分析 4.B12對嗜水氣單胞菌感染的保護作用依賴于腸道微生物群 飼料中添加B12顯著提高了斑馬魚感染后的存活率，且與TCK組的對照組相比，TB組的斑馬魚的肝臟和腎臟中的嗜水氣單胞菌負荷也降低了。此外，觀察到肝臟和腎臟中B12水平與嗜水氣單胞菌負荷之間的強負相關關系。這些結果表明，B12在預防嗜水氣單胞菌感染方面具有保護作用。先前對斑馬魚的研究表明，抗生素的使用可以破壞和清除腸道微生物。在喂食試驗之前，用含有混合抗生素的飼料喂養斑馬魚，以耗盡共生微生物。在斑馬魚感染嗜水氣單胞菌后，沒有觀察到肝臟和腎臟中氣單胞菌負荷的下降，這伴隨著保護作用的消除。此外，還發現B12對斑馬魚的保護作用是濃度依賴性的，推測有一小部分高外源性B12未被吸收，到達遠端腸道，在那里它們可以與微生物群相互作用。 圖4 腸道微生物群是B12保護斑馬魚減少嗜水氣單胞菌感染的基礎 5.維生素B12誘導腸道微生物組結構和功能的改變 對照組和B12補充組兩組之間存在明顯的分離性，這表明飼料中添加B12顯著改變了腸道微生物群落結構，且喂食維生素B12的斑馬魚在感染嗜水氣單胞桿菌后腸道微生物群落組成更穩定，說明膳食中添加B12對腸道健康有很大的貢獻。進一步評估兩組間細菌組成變化，發現B12補充組中與腸道微生物群失調相關的志賀氏菌和大腸桿菌減少，而許多潛在的有益微生物增加。厭氧菌是維持腸道內穩態的關鍵調控因子。B12處理后，厭氧菌的相對豐度顯著增加，說明B12可能促進了腸道中厭氧微生物的富集。添加B12顯著提高了腸道微生物群的多樣性和群落結構，也影響了腸道的氧化還原狀態，改善了腸道菌群之間的相互作用。 圖5 維生素B12誘導腸道微生物群結構和功能的改變 6. B12增強了腸道生態網絡的復雜性和穩定性 通過CK和B網絡中的大模塊分析以及B12攝入后腸道微生物相互作用的潛在變化，發現B的腸道微生物生態網絡比CK的更穩定。此外，補充B12后，模塊中OTUs的組成發生了顯著改變。在CK網絡中，變形菌門和厚壁菌門占主導地位，而在B網絡中，只有變形菌門占主導地位。在本研究中，在B網絡中只檢測到一個網絡樞紐和一個模塊樞紐。同時，與CK網絡相比，B網絡有更多的連接器，說明B12的補充顯著增強了腸道菌群之間的相互作用關系。有趣的是，檢測到的網絡樞紐（OTU0155）和模塊樞紐（OTU0026）以及大多數連接器都是罕見的類群，表明較少的細菌在微生物生態網絡中發揮調節作用。 圖6 維生素B12注入腸道生態網絡 通過構建PLS-PM模型去量化關鍵類群和網絡復雜性對宿主的病原體抗性的影響，結果表明，添加B12主要通過注入腸道中潛在的關鍵物種，提高腸道微生物生態網絡的復雜性，來提高宿主對病原體的抗性。 圖7 PLS-PM分析結果及B12增強了斑馬魚腸道內的緊密連接結果 7. B12維持了病原體感染后腸道緊密連接蛋白的正常表達 腸道屏障的通透性是病原體形成腸道感染結果的基礎，因此，通過Western blot（WB）檢測了腸道中主要緊密連接蛋白（Claudin15、Occludin和Zo-1）的表達。結果顯示，添加B12顯著上調了Claudin15、Occludin和Zo-1。相比之下，ACK和AB之間的Claudin15、Occludin和Zo-1的表達沒有差異。這表明，B12注入的腸道微生物群網絡維持了病原體感染的斑馬魚中腸道緊密連接蛋白的正常表達。
結 論
本研究結果BV1704-Y可以控制組織中的致病負荷，提高斑馬魚的存活率。基因組分析和代謝分析表明，鯨桿菌具有產生維生素B12的能力，補充維生素B12可降低腸道內的氧化還原電位，誘導腸道微生物群結構和功能的改變，改善微生物間的相互作用，增強腸道微生物群網絡的穩定性。其通過影響腸道菌群網絡調結腸道的緊密連接蛋白，并保護宿主免受病原體感染。這一發現可能會加深對益生菌對宿主健康影響的理解，并有助于闡明維生素B12對病原體感染的健康益處。
本研究的細菌完成圖測序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：021-80118168-8617）！
文章索引： Xiaozhou Qi, Yong Zhang, Yilin Zhang, et al. Vitamin B12 produced by Cetobacterium somerae improves host resistance against pathogen infection through strengthening the interactions within gut microbiota[J]. Microbiome, (2023) 11:135.
