2023-05-23
《Frontiers in Microbiology》 影響因子：6.064
文章題目：Hybridization alters the gut microbial and metabolic profile concurrent with modifying intestinal functions in Tunchang pigs 浙江大學在《Frontiers in Microbiology》上發(fā)表了雜交在改變屯昌豬腸道功能的同時，也改變了腸道微生物和代謝特征的研究結果。
研究背景
雜交技術已廣泛應用于中國野豬中，以提高其生長性能及保留優(yōu)良性狀。目前大多數(shù)研究普遍在基因組的基礎上分析這種表型差異。據(jù)研究報道稱，腸道環(huán)境對豬的機體健康和生產(chǎn)性能有重大影響，然而，人們對純種豬和雜種豬的腸道菌群、代謝物和腸道功能差異知之甚少。已有證據(jù)表明，巴屯豬（BT）的生長性能優(yōu)于屯昌豬（TC），且保留了屯昌豬肉品質(zhì)較好的性狀。然而，TC豬和BT豬腸道環(huán)境的差異尚不清楚，更別提腸道環(huán)境對表型的潛在影響及調(diào)控機制。因此，作者設計了多種實驗方法來比較TC豬和BT豬在腸道菌群、代謝物和腸道功能的差異。
技術路線
研究內(nèi)容
雜交可改善TC豬的營養(yǎng)代謝 雜交顯著提高了TC豬的體重（圖1A），平均日增重和采食量也有所增加（圖1B，D）且飼料轉(zhuǎn)化率也降低了（圖1C）。另外，腸道形態(tài)是維持機體代謝的關鍵。故收集了生長期的TC豬和BT豬的腸道組織，并通過HE染色切片發(fā)現(xiàn)雜交的BT豬只有十二指腸的腸形態(tài)發(fā)生了變化（圖2A-D），表明TC豬和BT豬的腸道形態(tài)總體相似。因此，推測兩者在生長性能的差異可能是由腸道功能和腸道微生物群引起的。 圖1 雜交前后TC豬生長性能指標測定 圖2 TC豬和BT豬的十二指腸、空腸和回腸組織學分析 接著，通過檢測生長期的TC豬和BT豬不同腸段的并與腸道功能相關的mRNA表達比較腸道功能差異。發(fā)現(xiàn)雜交后結腸中腸道發(fā)育和增殖相關的mRNA表達下調(diào)（圖3C）。此外，雜交豬小腸內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝和吸收相關的mRNA表達均上調(diào)（圖3A、B），包括鋅轉(zhuǎn)運體1（ZNT1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運體2（GLUT2），這些轉(zhuǎn)運體的較高表達可能有助于提高BT豬的生長性能。 圖3 RT-PCR檢測腸道功能相關基因mRNA表達量 雜交降低了TC豬的腸道屏障功能 腸道屏障在哺乳動物的代謝和免疫過程中起著重要的作用。值得注意的是，雜交豬結腸中腸屏障的mRNA表達下調(diào)，包括再生家族成員3 gamma（REG3G）和occludin（圖3C）。據(jù)報道REG3G同時具有抑菌和殺菌活性，而occludin與腸道通透性正相關。另外，雜交豬的血清LPS濃度較高（圖4），推測雜交削弱了TC豬的腸壁屏障功能。 圖4 ELISA試劑盒檢測血清LPS濃度 TC豬和BT豬的微生物群落豐富度相似但多樣性不同 為了實現(xiàn)全面的比較，我們檢測了微生物的豐富度和多樣性。宏基因組分析來源于9頭TC仔豬和9頭BT仔豬，并以斷奶前、斷奶后和生長期三個時間節(jié)點縱向采集的54份樣本，平均每個樣本獲得46,007,294.19個reads。本文采用Simpson、Chao1、ACE和Shannon指數(shù)對 α 多樣性進行了估計（圖5A-D）。這些指標在TC豬和BT豬之間均無顯著差異，說明觀察到的類群數(shù)量相近。接著，采用基于Bray-Curtis距離的主坐標分析（PCoA，圖5E-G）評估beta多樣性。發(fā)現(xiàn)TC豬和BT豬之間表現(xiàn)出細菌群落的組成差異。值得注意的是，微生物組成差異在斷奶期最為顯著(p = 0.001)。這些數(shù)據(jù)表明，雜交會改變TC豬的腸道微生物組成和豐度。 圖5 TC豬和BT豬不同生長階段微生物群落豐富度和多樣性的比較 TC豬和BT豬的微生物群落動態(tài)和優(yōu)勢菌群隨年齡的變化而變化 如圖6A所示，所有樣品中優(yōu)勢門是厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門。在屬水平上，大多數(shù)菌群的變化趨勢從斷奶前到生長期均呈一致的逐步增加或減少（圖6B）。而乳酸菌屬在TC豬和BT豬中差異最大，不僅在變化趨勢上，在相對豐度上也有明顯差異。現(xiàn)有的種水平數(shù)據(jù)顯示，這種差異主要是由羅伊氏乳桿菌，約氏乳桿菌和食淀粉乳桿菌引起。 圖6 TC豬和BT豬不同階段高豐微生物群落組成及差異 網(wǎng)絡推理的目的是識別跨物種顯著共相關性的微生物組合，并將它們組合成一個網(wǎng)絡。網(wǎng)絡分析還可以揭示為什么一些微生物群總是一起出現(xiàn)，或者某些微生物類群對維持網(wǎng)絡結構是否更重要。顯然，在斷奶前階段，普雷沃氏菌是優(yōu)勢菌屬和核心菌屬，與許多其他細菌呈正相關（圖7A）。然后，普雷沃氏菌和乳酸桿菌在斷奶期與其他菌群表現(xiàn)出大量的相關性（圖7B），表明它們在斷奶應激下的穩(wěn)定性和重要性。在生長階段，普雷沃氏菌的核心屬被多個屬所取代，如網(wǎng)絡所示（圖7C），表明腸道菌群趨于穩(wěn)定。最重要的是，網(wǎng)格分析說明雜交不僅改變了TC豬的微生物的組成，而且改變了微生物菌間的互作。 圖7 不同階段細菌網(wǎng)絡的相關分析 通過腸道宏基因組預測TC豬和BT豬的功能 為了比較TC豬和BT豬的特定生理特性，我們接下來對不同階段的腸道宏基因組數(shù)據(jù)進行了KEGG分析。KEGG分析顯示雜交促進了斷奶前許多芳香氨基酸的生物合成，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸（圖8A）。有趣的是，這些芳香族氨基酸參與了黑色素的生物合成，可能與TC豬和BT豬的毛色差異有關。然后，檢測到PPAR信號通路在雜種豬的富集程度降低（圖8B）。最后，在BT豬的生長階段檢測到“NOD受體信號通路”的富集（圖8C），該通路與細菌感染相關。同時，一些與腸屏障功能相關的通路在雜交豬中顯著降低，這些數(shù)據(jù)與上一章腸道功能的結論一致。 圖8 腸道宏基因組中KEGG通路的富集分析 TC豬和BT豬在不同階段的主要代謝物 非靶向代謝組學分析揭示了TC豬和BT豬在不同生長階段的模式差異（圖9B-D），表明雜交改變了TC豬的代謝過程。此外，羧酸類及其衍生物在這些初級代謝物中所占比例最大（圖9A）。在斷奶期和生長期，羥基酸及其衍生物的種類也存在顯著差異。然而，存在顯著差異的初級代謝物是脂肪酸和類固醇，包括一些前列腺素和短鏈脂肪酸相關代謝物（圖10A-C），這些代謝物均與腸道炎癥和發(fā)育有關。 圖9 雜交改變了代謝組成模式 圖10 TC豬與BT豬差異代謝物及代謝途徑分析 在次級代謝物上，微生物發(fā)酵活性的一個重要指標是醋酸酯、丙酸酯和丁酸酯的相對含量。它們在維持腸道功能和完整性方面也起著重要作用。所有樣品中乙酸、丙酸、丁酸的比例基本接近，其中乙酸占比最大（圖11A-D）。然而，雜交降低了TC豬腸道內(nèi)容物中乙酸的比例，而增加了丁酸的比例。 圖11 醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽各階段的變化趨勢 TC豬和BT豬之間的代謝通路隨時間的變化 斷奶前雜交后“花生四烯酸代謝”、“產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡”、“亞油酸代謝”和“苯丙氨酸代謝”富集（圖10D）。同樣，“PPAR信號通路”在斷奶期雜交后也不富集（圖10E），表明雜交可能下調(diào)TC豬的脂質(zhì)代謝和脂肪細胞分化。此外，在斷奶期雜交后，“膽汁分泌”通路受損，這增加了腸道炎癥的風險，因為膽汁酸是小腸有效脂質(zhì)吸收所必需的，并且在小腸中具有強大的直接和間接抗菌功能。 微生物組與代謝物的相關性分析 為了排除外在因素的影響，通過PERMANOVA驗證了母體效應和性別對所選的差異代謝物沒有影響（表1）。通過計算Spearman相關系數(shù)和p值進行相關性分析。數(shù)據(jù)表明，斷奶前的優(yōu)勢菌普雷沃氏菌與前列腺素代謝產(chǎn)物呈正相關（圖12A），這些代謝物與慢性炎癥有關。然后，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異次級代謝物在斷奶期被分類為脂肪?；皖惞檀技捌溲苌铮@些代謝物大多與瘤胃球菌和乳酸菌相關（圖12B）。同時，乳酸菌與炎癥相關代謝物呈負相關，而顫桿菌則發(fā)揮相反的作用（圖12C）。這些結果證實了我們的懷疑，即TC豬和BT豬之間的腸道環(huán)境受到微生物群落的改變，并揭示了乳桿菌的抗炎作用。 表1 差異代謝物結果 圖12 微生物組與代謝的相關性分析
研究結論
本研究采用宏基因組學和非靶代謝組學的方法對雜交巴屯豬（BT）和純種屯昌豬(TC)的腸道微生物多樣性和代謝組成進行了檢測分析，并結合多項分子實驗共同解析腸道微生物群如何影響TC和BT豬的性狀，包括生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和免疫反應。此外還探討了宿主-微生物相互作用的潛在機制。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)為雜交在腸道微生物群-代謝組相關性中的作用提供了新的見解，為未來的微生物群移植和豬育種計劃提供了理論基礎。
本研究的宏基因組測序、代謝組測序及部分數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引： He J, Zhang Y, Li H, Xie Y, Huang G, Peng C, Zhao P, Wang Z. Hybridization alters the gut microbial and metabolic profile concurrent with modifying intestinal functions in Tunchang pigs. Front Microbiol. 2023 Apr 20;14:1159653. doi: 10.3389/fmicb.2023.1159653.
