2023-04-25
《Environmental Science & Technology》
影響因子：11.357
上海交通大學在國際著名雜志《Environmental Science & Technology》發表了二甲雙胍的微生物代謝途徑，為其污染環境的生物修復提供了一種潛在策略。
技術路線
研究背景
釋放到環境中的藥品往往仍然具有藥物活性且長期存在，對生態環境和人體健康具有潛在風險，已納入公認的新污染物范疇。二甲雙胍作為全球使用量最多的處方類藥物之一，已成為環境中檢出濃度和頻率最高的新污染物之一。盡管二甲雙胍的微生物降解研究受到了廣泛關注，通過環境原位檢測、活性污泥和菌群處理等研究檢測到多種二甲雙胍微生物降解中間代謝產物，但缺乏純培養的二甲雙胍降解菌株，因此對于二甲雙胍的微生物代謝途徑尚未知曉。
研究材料與方法
1、實驗材料
Aminobacter sp 菌株 NyZ550
2、測序平臺
Illumina HiSeq，Agilent 6470
3、分析方法
RNA-seq，基因組測序，LC?MS，GC-MS
研究結果
1.廢水中微生物降解MET的能力
本研究為了比較不同廢水樣品中微生物對MET的降解能力，進行了批量培養生物降解試驗。將含有MET的MSM與來自不同污水處理廠的廢水接種，并隨時間測量MET濃度(圖1)。結果顯示微生物可能適應或進化MET降解，并且MET沒有通過非生物方式轉化。
圖1中國12個污水處理廠廢水微生物群落對MET的降解能力
2.從污水中分離到可用的MET細菌。
對具有MET降解能力的微生物進行富集，從不同的樣品中獲得5株具有系統發育相關性且能在MET上生長的Aminobacter sp菌株，進行16S rRNA測序。這些菌株對MET具有相似的降解行為，因此，從樣品中分離出菌株NyZ550進一步分析。隨著生物量的增加，菌株NyZ550在60 h內幾乎完全降解MET(圖2)
圖2 Aminobacter sp. 菌株 NyZ550生長曲線
3.分解產物GUA的鑒定
考慮到菌株NyZ550分離的SH樣品中GUA與MET的比例極高，我們假設GUA是一種降解代謝物。因此，采用LC- MS對菌株NyZ550在MET上生長過程中產生的代謝物進行鑒定，與真實的GUA(圖4)進行比較。結果表明GUA不能作為生長的碳源或氮源(圖3)，所以GUA是菌株NyZ550降解MET的終端產物。
圖3 MET降解產物GUA和DMA的鑒定
圖4 MET降解產物與GUA比對
4.鑒定DMA作為另一種初始降解產物
以上證據表明，NyZ550對MET的生物降解隨濃度的增加而增加最終產物GUA，但支撐NyZ550生長的中間體是未知的。于是提出了細菌將MET轉化為GUA的兩種可能途徑，一種是通過去甲基化，另一種可能的途徑是MET的直接水解和DMA的可能釋放。通過酶促反應檢測DMA，結果表明DMA是NyZ550的有利生長物，而不是GUA(圖5)。
圖5 菌株NyZ550生長對多種含氮化合物的影響
5.菌株NyZ550 MET降解相關基因
為了進一步闡明菌株NyZ550對MET的降解機制，我們進行了全基因組和轉錄組分析，共檢測到5883個表達基因，其中上調107個基因，下調104個基因(圖6)。KEGG富集分析主要集中在光合作用、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、甲烷代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等途徑中(圖6)。此外，GO富集分析結構顯示，上調基因顯著富集于三羧酸循環和單碳代謝過程，表明這些過程可能參與MET降解。
圖6 轉錄組分析
6.菌株NyZ55 MET降解途徑相關基因
根據基因組注釋，菌株NyZ550基因組中編碼甲胺降解的基因簇有兩個(圖7A)。轉錄組數據顯示，菌株NyZ550在MET上生長期間，dmm、gmas、mgs 和 mgd基因的轉錄受到高度誘導，表明它們編碼了酶DMA。根據代謝產物分析和轉錄組測序結果，推斷菌株NyZ550對MET及其中間體的降解機制，如圖7B所示。NyZ550基因組中沒有GUA水解酶，這與MET降解過程中GUA的積累一致。
圖7 MET降解途徑及相關基因
7.構建細菌混合物降解MET和GUA的研究
本研究關于MET分解代謝的結果和菌株NyZ550所涉及的基因清楚地表明，GUA的轉化是其分解代謝的障礙。因此，構建了一個完全降解MET和GUA的細菌混合物，由菌株NyZ550和P. putida PaW340組成，其中含有GUA水解酶基因(圖6A)，圖6B是GUA的降解速度，12小時后觀察到GUA完全降解。結果表明構建的細菌混合物能夠完全降解水中的MET和GUA，為MET污染環境的生物修復提供了一種潛在的策略。
圖8 細菌混合物完全降解MET和GUA
小結
研究首先調研了全國12個污水處理廠污水樣品中的二甲雙胍及其代謝產物的污染情況，在所有樣品中均檢測到μg/L水平的二甲雙胍及其代謝產物的總累積濃度，同時檢測了污水樣品中的土著微生物對于二甲雙胍的降解能力，最終分離到一株能以二甲雙胍為唯一碳、氮源生長的菌株，將其命名為Aminobacter sp 菌株 NyZ550。通過同位素標記、離子色譜、質譜檢測等技術鑒定NyZ550代謝二甲雙胍的直接代謝產物為胍基脲和二甲胺，并借助轉錄組測序確定菌株NyZ550代謝二甲雙胍的關鍵基因簇，提出了其完整的代謝途徑。該代謝途徑可能與環境中頻繁檢出的高濃度胍基脲殘留有關，其生態意義有待進一步探究。
本研究的部分測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
