2023-04-24
《Science of the Total Environment》 影響因子：10.753 近日，上海交通大學生命科學與生物技術學院在環境科學與生態學領域的《Science of the Total Environment》發表新研究成果！本研究分離并鑒定了一株新菌株Shinella sp. FLN14，該菌能以芴為唯一碳源，有效地協同代謝多種多環芳烴和雜環衍生物，并提出了兩種可能的代謝途徑(即水楊酸途徑和鄰苯二甲酸途徑)。在基因組研究時發現，除了一些新的雙加氧酶和電子傳遞鏈外，菌株FLN14中沒有發現新的芴降解功能基因簇。在廢水生物修復中，菌株FLN14在5天內去除了近95%的多環芳烴，并在18天的反應中保持了較高的降解活性。總之，本研究為實現多環芳烴污染環境的生物修復提供了一個有價值的候選方案。 一、研究背景 多環芳烴由兩個或多個密集排列成線性、角狀或簇狀的芳香環組成，其具有遺傳毒性、致癌性和誘變性，對人類健康構成嚴重威脅，已成為世界范圍內研究的熱點。目前利用生物技術，如引入微生物代謝多環芳烴，已成為一種很有前途的修復多環芳烴污染的方法。自然界中可以降解多環芳烴的微生物包括細菌、真菌和藻類生物，其中，細菌種類因分布廣泛、降解資源豐富而備受關注。由于廢水中多環芳烴及其雜環衍生物的普遍存在，獲得高效的細菌進行環境生物修復非常重要。本研究分離并鑒定了一株能夠高效降解芴的新菌，該菌具有廣譜的PAHs降解底物。此外，通過對人工廢水的生物修復模擬實驗發現該菌具有穩定的降解能力，表明該菌株未來可用于污水修復。
二、研究材料與方法 1、實驗設計 2、實驗材料 某焦化廠多環芳烴污染污泥中分離到菌株Shinella sp.FLN14 3、測序平臺 Illumina NovaSeq + PacBio 4、分析內容 細菌完成圖測序、代謝組測序。
三、研究結果 1、Shinella sp. FLN14的分離鑒定 從多環芳烴污染的污泥中分離到一株降解芴的新菌株，根據16S rRNA基因構建的系統發育樹，將菌株FLN14歸入Shinella屬，FLN14與Shinella zoogloeoides親緣關系密切。同時，FLN14菌株對氨芐西林、鏈霉素、氯霉素等多種抗生素具有耐藥性。 2、生長條件和對芴的降解能力 將FLN14菌株置于僅含多環芳烴作為碳源和能量來源的礦物鹽培養基上，以確定最佳生長條件。FLN14菌株在以芴為唯一碳源生長時，初始滯后期短，生長濁度高。與其他溫度相比，以芴為唯一碳源的FLN14在30°C下生長最佳。在高溫(≥37℃)下，FLN14的生長速率急劇下降。生長的最佳pH值為7.0，最適宜的轉速為200 rpm。此外，該菌株在4 mg芴培養時表現出最大的生長和降解?？傮w而言，MSM培養基的最佳生長溫度、搖瓶速度和pH分別為30°C、200 rpm和pH 7.0，400 mg/L的芴是適宜的添加水平。在最佳生長條件下，測定FLN14的生長和降解能力，發現菌株FLN14在6天內完全降解芴。 圖1：熒光培養Shinella sp. FLN14的生長條件和降解能力 3、降解聯合體的分解代謝活動 幾種多環芳烴和雜環衍生物抑制了Shinella sp. FLN14的生長，而靜止FLN生長的細胞能夠降解這些成分。除芴外，FLN14還能協同代謝菲(PHE)、苊(ACE)、二苯并呋喃(DBF)、蒽(ANT)、氟蒽(FLU)和苯并[a]蒽(BaA)。該菌株在4小時內降解DBF (100 mg/L)達37.4%，ANT (10 mg/L)達98.2%，FLN14在19小時內利用FLU (15 mg/L)達79.1%，BaA (10 mg/L)達63.9%。相比之下，當使用NAP (50 mg/L)、DBT (50 mg/L)和BaP (10 mg/L)時，沒有實現降解。 表 菌株Shinella sp. FLN14在靜息細胞反應中對多環芳烴的降解速率 4、多環芳烴中間體的鑒定 PHE、 DBF和ANT是FLN14菌株破壞的低分子量多環芳烴(LMW -PAHs)的一小部分，它也可以利用一些高分子量多環芳烴(HMW -PAHs)，包括FLU和BaA。GC-MS用于鑒定菌株FLN14降解過程中產生的潛在多環芳烴中間體。 4.1芴、苊、菲、蒽的降解途徑研究 GC-MS分析鑒定了芴、苊、菲、蒽代謝過程中產生的中間體：結果表明FLN14中芴降解過程中可能存在水楊酸途徑和鄰苯二甲酸途徑，這與芴降解基因簇驅動的降解途徑一致，但芴降解的代謝途徑有待進一步闡明；苊降解研究鑒定出了相關的中間產物，如苊-1-醇、苊-1(2H)- 1、苊-1,2-二醇(BSTFA衍生物)和鄰苯二甲酸(BSTFA衍生物)等，表明FLN14具有假定的苊代謝途徑；從菲發酵樣品中鑒定出新的中間質譜峰，鑒定出9,10-二羥基菲、9,10-菲醌、9 -菲酚和鄰苯二甲酸(BSTFA衍生物)等中間體，表明FLN14通過以氧化第9和第10個碳原子為初始步驟的途徑降解菲。而進行蒽進行研究的時候發現了ANT -9,10位代謝途徑的標志性中間代謝物蒽酮，這可能是9,10-二羥基蒽自發氧化的結果。然而，細菌在蒽中代謝的中間產物中沒有蒽酮的報道。因此，推測蒽酮的形成是在9-蒽醇被氧化時自發發生的，這可能是由不穩定的二氧化合物氧化的。 圖2：菌株FLN14代謝雜環化合物和多環芳烴的途徑 4.2熒光蒽、苯并噻吩降解途徑 將FLU與NIST MS數據庫進行比較，GC-MS檢測到的主要產物有苊-1-(2H)- 1、1,2-苊二酮、衍生苊、苊1、2-二醇和鄰苯二甲酸。從檢測到的產物來看，FLN14很可能通過以下途徑：氟蒽在c -7,8位雙氧合，然后進行間位裂解和多步反應，生成苊(BSTFA衍生物)、苊-1-醇、苊-1(2H) 1、苊-1,2-二醇、水楊酸(BSTFA衍生物)和鄰苯二甲酸(BSTFA衍生物)。前者途徑的最終產物與ACE途徑相同。在DBF代謝方面，通過GC-MS共鑒定出8種代謝物，通過與數據庫的比對，這8個化合物分別是2-二苯并呋喃醇、2香豆酮、鄰苯二甲酸(BSTFA衍生物)、鄰苯二酸酐、水楊酸(BSTFA衍生物)、1,1′-聯苯- 2,2′-二醇、3-羥基-9H-占噸-9-酮和水楊酸。 4.3基因組測序與分析 為了更深入地了解Shinella sp. FLN14的芴降解機制，對其整個基因組進行了分析。FLN14全基因組由1條環狀染色體和4個小質粒組成，共含有1,486,534,344個堿基，G + C含量為62.96%。大多數差異檢測到的功能基因被預測并參與了芳烴的降解途徑，如萘、硝基甲苯、苯甲酸鹽、氨基苯甲酸鹽、氯烷烴和氯烯烴，以及多環芳烴。細菌通常傾向于加氧酶介導的代謝來降解多環芳烴，并使用單加氧酶或雙加氧酶。菌株FLN14的基因組分析發現存在13個單加氧酶和27個雙加氧酶?；谕ㄟ^NR、eggNOG和KEGG數據庫獲得的基因注釋，以及已報道的與多環芳烴代謝相關的基因序列的同源比對，FLN14中未發現能夠降解芴的新功能基因簇。 圖3：基因組測序和分析 4.4混合底物對Shinella sp. FLN14廢水的生物修復及降解穩定性 為了更好地實施Shinella sp.的實際修復過程，在復合污染廢水中，構建了活性污泥反應器進行生物降解實驗。根據復合污染廢水中FLN14和常見底物的底物降解效率，選擇FLN、DBF和FLU作為混合底物，其濃度分別為200、50和10 mg/L。與對照組相比，在8天孵育的前6天，實驗組的混合底物含量迅速下降。添加FLN14后，FLN的降解率在6 d內從10.17%顯著提高到82.6%，DBF和FLU的降解率在8 d內也分別從9.78%和9.1%提高到95.17%和59.13%。這些結果表明，FLN14具有顯著的沉降性能，可能是廢水生物修復的優良資源。通過三次循環實驗，證實了FLN14的降解穩定性。在初始接種FLN14的同時注射三種多環芳烴的混合底物。5天后，離心收集FLN14，注入等量的工業廢水和多環芳烴，開始下一輪降解。與對照組相比，FLN14在18天的反應中保持了較高的活性。在第一輪反應中，FLN幾乎完全降解。由于細菌質量的積累和細胞高代謝活性的維持，在接下來的兩輪反應中，FLN14對FLN、DBF和FLU具有較高的降解率，在每輪反應的后期，每種底物的降解率都接近95%。相比之下，對照組混合底物的殘留量在每個循環后略有下降，說明原生微生物可能包括多環芳烴降解菌。綜上所述，菌株FLN14可作為一種有前景的菌株進行有效的廢水修復，因為它可以保持較高的降解活性。 圖4：混合基質的小型廢水生物修復
四、結 論 綜上所述，本文研究了一株新菌株Shinella sp. FLN14，該菌株能夠以芴為唯一碳源，共同代謝多種多環芳烴和雜環衍生物，此外，還針對上述中間體提出了多種降解途徑。根據遺傳信息，除了雙加氧酶和電子傳遞鏈外，無法在FLN14中發現能夠降解芴的新功能基因簇。此外，FLN14僅在8天后就能幾乎完全降解環境污水中的混合多環芳烴和雜環衍生物(包括FLN、DBF和FLU)，并且FLN14在18天反應中保持高活性。綜上所述，這些結果表明FLN14是一種具有多種PAHs降解能力的新型高效菌株，可能有助于生物降解，加深人們對廢水修復的認識。
本研究的細菌基因組測序與分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：021-80118168-8617）！
文章索引： Wang Z, Hu H, Zhang Z, et al. lA multiple PAHs-degrading Shinella sp. strain and its potential bioremediation in wastewater[J]. Science of The Total Environment, 2023, 879: 162974.
