2023-04-11
Nature Communications 影響因子：17.694
文章題目 BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism 上海交通大學蔣欣泉團隊在Nature Communications上發表BRD9介導的染色質重塑通過負反饋機制抑制破骨細胞的發生研究的成果。
一、研究背景
形成骨的成骨細胞與溶解吸收骨的破骨細胞（骨的兩個主要細胞成分）之間的協調是維持骨骼的功能和穩態的重要細胞基礎。溴結構域蛋白9（BRD9）是非典型BAF染色質重塑復合物的一個組成部分，為血液病的重要治療靶點。盡管破骨細胞起源于造血細胞，但BRD9在破骨細胞形成和骨疾病中的作用仍未得到解決。在這里，我們發現髓系中BRD9缺失通過下調干擾素-β（IFN--β）信號來增強破骨細胞譜系定型和骨吸收。值得注意的是，我們發現BRD9與轉錄因子FOXP1相互作用，激活Stat1轉錄，從而介導下游IFN-β信號通路激活。作者利用BRD9和柔性可注射絲光固化絲蛋白水凝膠的藥理調節優勢，設計了一種局部給藥系統，有效減輕唑來膦酸（ZOL）相關的頜骨壞死（ONJ），減輕脂多糖（LPS）誘導的局部侵襲性牙周炎的急性骨丟失。總之，這些結果證明了BRD9在破骨細胞形成中的作用及其對骨疾病的治療潛力。
二、技術路線
三、研究內容
1、髓系Brd9的缺失導致骨量減少 為了研究BRD9在破骨細胞生成中的作用，檢查了其在破骨細胞譜系細胞中的表達模式。構建缺失BRD9小鼠LysM-Cre;Brd9fl/fl，通過分子實驗驗證，結果表明骨髓系中Brd9的缺失導致骨量減少 (圖1)。 圖1：骨髓系中Brd9的缺失導致骨量減少 2、Brd9缺失增強體內破骨細胞細胞系定型 為了研究髓系細胞譜系Brd9缺失后骨量減少的細胞機制，分別檢查了破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成。對破骨細胞的大小、數量進行了分析，對股骨進行了免疫熒光染色，結果表明在失去Brd9后破骨細胞細胞系定型和骨吸收增強 (圖2)。 圖2：骨髓譜系中Brd9的缺失導致體內破骨細胞細胞系定型增強 3、在體外BRD9抑制RANKL誘導的破骨細胞分化 在RANKL誘導后，使用不同濃度BRD9的選擇性細胞化學抑制劑iBRD9處理24小時后，破骨細胞的數量和大小隨劑量依賴性增加，BRD9抑制劑在沒有RANKL誘導的情況下對破骨細胞生成沒有明顯的作用（圖3)。結果表明，在RANKL處理后上調的BRD9以負反饋機制抑制RANKL誘導的破骨細胞分化，并且BMDMs中BRD9的基因缺失和抑制均持續促進破骨細胞分化。 圖3：BMDM中的BRD9缺失和抑制導致體外破骨形成過度激活 4、BRD9通過干擾素-β 信號傳導抑制破骨細胞生成 在破骨細胞與M-CSF和RANKL (MR+iBRD9) 和對照組 (MR+vector) 分化過程中，對BMDMs進行了mRNA測序。在生物過程中，GO term主要富集在防御反應、對干擾素-β (IFN-β)和外部刺激的反應、免疫系統過程(圖4b)。GSEA揭示了IFN-β 反應、乙酰膽堿受體信號和免疫受體活性在MR+iBRD9組被顯著下調，而核糖體生物發生、突觸傳遞和rRNA加工被上調 (圖4c，d)。RANKL在破骨細胞形成過程中激活IFN-β，STAT1，STAT2，從而促進IFN-β 信號傳導 (圖4e)。而在iBRD9處理后，RANKL誘導的BMDMs中IFN-β 信號活性被下調 (圖4f)。我們認為BMDMs中brd9介導的IFN-β信號通路的可能負反饋調節破骨細胞的形成。 圖4：BRD9介導的干擾素-β信號的轉錄激活負調控破骨細胞的形成 5、Stat1抑制BRD9介導破骨細胞生成至關重要 為了進一步闡明BRD9如何在RANKL誘導的破骨細胞生成的負反饋過程中參與轉錄調控，進行了ChIP 測序。KEGG富集分析揭示了BRD9的關鍵轉錄調控在信號轉導、信號分子和相互作用以及免疫應答方面的富集 。蛋白質-蛋白質相互作用 (PPI) 分析確定了基因列表中的幾個關鍵樞紐基因可能是BRD9的直接下游靶標。通過一系列分子實驗，結果表明，BRD9通過直接調控Stat1的啟動子和增強子活性來促進Stat1的轉錄 (圖5)。 圖5：在破骨細胞形成過程中，STAT1對于BRD9介導的負反饋調節至關重要 6、FOXP1與BRD9在Stat1轉錄調控上相互作用 為了研究BRD9的染色質重塑功能以及可能促進BRD9在破骨細胞形成中的負面作用的輔助因子，進行了ATAC-seq和motif分析。結果表明MXI1、SRY、Arid3a、ZNF354C、FOXP1與BRD9有潛在的協同作用。共免疫沉淀 (IP) 證實了BRD9和FOXP1之間的相互作用 (圖6)。利用慢病毒載體進行了ChIP-qPCR和FOXP1敲低實驗，進一步驗證FOXP1對Stat1的結合和轉錄調控功能（圖6k，I）。這些結果清楚地表明，在Stat1轉錄激活期間，FOXP1是BRD9的關鍵輔因子之一，并且在破骨細胞分化期間負反饋調節。 圖6: FOXP1與BRD9相互作用，在破骨細胞形成過程中調節Stat1的轉錄 7、BRD9降解劑減輕ZOL相關的ONJ 利用BRD9的藥理調節和柔性注射SF生物材料支架的優勢，設計了一種針對拔牙缺損的局部骨再生系統，可有效預防和緩解ZOL相關的ONJ（圖7）。為未來有長期ZOL用藥史的患者預防或有效緩解ONJ提供了一種很有前途的治療策略。 圖7：BRD9降解物緩解拔牙后ZOL相關的ONJ 8、BRD9缺失/降解減輕脂多糖誘導的骨吸收 為了測試dBRD9對LPS/ligation誘導的急性牙周炎和牙槽骨丟失的預防和治療潛力，進一步注射SF含有BRD9降解劑，并在LPS/ligation誘導期間注入牙周組織。結果表明，在感染刺激的情況下，骨組織中BRD9缺失或降解的抗炎作用可能更為突出(圖8)。 圖8:BRD9缺失/降解物緩解LPS誘導的骨吸收
本研究的轉錄組測序、ATAC-seq測序和部分分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引：Du, J., Liu, Y., Wu, X. et al. BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism. Nat Commun 14, 1413 (2023).
