2023-04-04
近期，吉林農(nóng)業(yè)大學李所課題組在《Environmental Pollution》和《Journal of Animal Science》上發(fā)表了高質量SMART-seq文章，小派今天就分享這兩篇有關豬卵母細胞轉錄組測序的文章解讀，文章的原文索引及鏈接見文章末尾。
文章一
甘氨酸通過調(diào)節(jié)豬卵母細胞線粒體-內(nèi)質網(wǎng)相互作用改善MBP誘導的減數(shù)分裂異常和凋亡 《Environmental Pollution》 影響因子：9.988 研究背景 鄰苯二甲酸單丁酯（MBP）是鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物。MBP具有穩(wěn)定的結構，可以在生物體中持續(xù)積累，并有可能損害動物和人類的生殖功能。在卵巢卵泡微環(huán)境中，DBP及其代謝物MBP可能導致卵泡發(fā)育和類固醇生成的缺陷，減數(shù)分裂成熟異常，卵巢功能受損和其他生殖缺陷。以前的研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸似乎能夠保護卵母細胞免受MBP誘導的損傷。在本研究中，通過SMART-seq探究MBP暴露對豬卵母細胞體外成熟（IVM）的影響。闡明MBP對卵母細胞毒性作用的潛在機制，并探索甘氨酸改善MBP誘導的豬卵母細胞損傷的機制。 技術路線 研究內(nèi)容 1、MBP對豬卵母細胞成熟和ROS水平的影響 首先，用不同MBP濃度（25 μm、50 μm、100 μm和200 μm）處理卵母細胞，評估MBP對卵母細胞減數(shù)分裂的影響。與對照組相比，MBP組中的卵丘細胞部分擴張或未擴張。對照組中的大多數(shù)卵母細胞已排出第一極體（PBI），而大部分卵母細胞在MBP處理后未能排出PBI。MBP處理組的PBI排出率以劑量依賴性方式顯著降低。也評估了卵母細胞成熟和死亡率。用ROS熒光強度評估MBP暴露是否導致氧化應激，在MBP暴露后ROS熒光強度顯著增強，結果表明卵母細胞經(jīng)歷了氧化應激損傷。 圖1. MBP暴露對豬卵母細胞減數(shù)分裂成熟的影響 2、MBP對豬卵母細胞mRNA表達的影響 為了研究MBP暴露對豬卵母細胞成熟的影響，進行了RNA-seq。在培養(yǎng)42小時后，MBP暴露組與對照組相比有149個基因的表達有顯著差異，92個上調(diào)的基因和57個下調(diào)的基因 （padj <0.05，fold change > 2）（圖2A）。對差異表達的基因進行GO富集分析。結果表明，MBP暴露后差異表達的基因在生物過程細胞骨架組織和細胞質微核中顯著富集。顯著富集的細胞成分包括ER伴侶復合物和線粒體外膜等（圖2C）。這些結果提供了關于MBP對豬卵細胞質量產(chǎn)生負面影響的功能途徑。 圖2.轉錄組分析評估MBP暴露對卵母細胞成熟的影響 3、甘氨酸對暴露于MBP的卵母細胞的影響 為了評估甘氨酸對MBP暴露后卵母細胞成熟的影響。觀察了紡錘體形態(tài)，驗證了CDC26 (中/晚期有絲分裂轉變調(diào)節(jié)因子) mRNA表達的變化（圖3）。表明甘氨酸改善了MBP誘導的豬卵母細胞減數(shù)分裂異常。 聚類分析表明，在MBP暴露后，內(nèi)質網(wǎng)伴侶復合物、線粒體外膜、線粒體和其他細胞成分顯著富集（圖4A）。在物理條件下，ER通過線粒體相關的ER膜（MAM）與線粒體相互作用。因此，使用Mander系數(shù)評估了ER膜(MAM)與線粒體之間的相互作用程度。結果表明MBP增加了線粒體與ER之間的相互作用，甘氨酸可以減少MBP誘導的線粒體和內(nèi)質網(wǎng)之間的相互作用。通過分析MFN1和MFN2的蛋白表達、相對熒光強度以及基因表達量，發(fā)現(xiàn)甘氨酸可能通過保護MFN1和MFN2的表達來減輕MBP誘導的ER與線粒體之間的相互作用。 ER和線粒體之間相互作用的增強導致兩個細胞器之間的鈣轉移增強，因此測量了MBP暴露后的豬卵母細胞的鈣離子水平，包括[Ca2+]i，[Ca2+]ER和[Ca2+]m。與對照組相比，單獨用甘氨酸治療的組的[Ca2+]i水平降低，而MBP組的[Ca2+]i水平明顯高于其他組，甘氨酸治療顯著降低[Ca2+]i水平（圖5B）。用特定探針對ER和線粒體進行染色，以評估細胞內(nèi)鈣離子的總體動態(tài)平衡。結果表明，[Ca2+]m水平的變化趨勢與四組[Ca2+]i水平的變化趨勢相同。（圖5D）。我們檢查了[Ca2+]ER水平的趨勢，MBP暴露組[Ca2+]ER水平顯著降低，而甘氨酸治療組的[Ca2+]ER水平明顯高于MBP組（圖5C）。 ROS和GSH的水平是氧化和抗氧化應激的主要指標。分析了ROS和GSH熒光強度，還分析了幾種氧化應激和抗氧化應激相關基因的mRNA表達。MBP暴露顯著上調(diào)MDA mRNA表達，甘氨酸治療后下調(diào)了MDA mRNA的表達；MBP暴露顯著下調(diào)了CAT的mRNA表達，甘氨酸治療后使CAT的mRNA表達恢復至正常水平（圖6)，結果表明，甘氨酸可以保護卵母細胞免受MBP暴露引起的氧化應激。 氧化應激通常誘導凋亡。聚類分析表明，幾個重要的凋亡相關基因的表達上調(diào)(圖7A)。為了研究MBP處理是否會導致豬卵母細胞的早期凋亡，對卵母細胞進行了Annexin V和Caspase3染色（圖7C和D），還分析了幾個凋亡相關基因的表達，MBP暴露后BAX和Caspase 3表達增加、差異表達基因AIFM1表達下調(diào)。這些結果表明，甘氨酸對MBP誘導的細胞凋亡具有保護作用。 圖3.甘氨酸對暴露于MBP的卵母細胞紡錘體形態(tài)的影響。 圖4.甘氨酸對MBP暴露卵母細胞線粒體和內(nèi)質網(wǎng)共定位的影響 圖5.甘氨酸對用MBP處理的豬卵母細胞中Ca2+水平的影響 圖6.甘氨酸對MBP暴露卵母細胞氧化應激的影響 圖7. 甘氨酸改善了MBP暴露對豬卵母細胞凋亡的影響 研究結論 該結果證實了甘氨酸對MBP誘導的豬卵母細胞的細胞質成熟受損具有保護作用。從細胞器的角度，本研究揭示甘氨酸可以通過降低MFN1和MFN2的表達，進一步降低[Ca2+]m的水平來調(diào)節(jié)MAM相互作用，從而改善卵母細胞線粒體功能，降低ROS水平和卵母細胞凋亡，并減輕MBP誘導的卵母細胞減數(shù)分裂和細胞骨架異常的毒性作用。這些結果有助于我們理解MBP影響卵母細胞質量的毒理學機制，并且甘氨酸可以潛在地用于防止MBP誘導的來自人類或其他用于胚胎工程技術的動物物種的卵母細胞中的缺陷。 本研究的轉錄組測序和部分數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。 文章一原文索引： Gao L, Zhang C, Yu S, et al. Glycine ameliorates MBP-induced meiotic abnormalities and apoptosis by regulating mitochondrial-endoplasmic reticulum interactions in porcine oocytes[J]. Environmental Pollution, 2022, 309: 119756.
文章二 甘氨酸調(diào)節(jié)脂質過氧化促進豬卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育
《Journal of Animal Science》 影響因子：3.338 研究背景 生產(chǎn)優(yōu)質配子是家畜繁殖和種質資源保存的前提，尤其是優(yōu)質卵母細胞。體外成熟（IVM）培養(yǎng)已成為獲得成熟卵母細胞的重要途徑，但體外培養(yǎng)的卵母細胞與體內(nèi)卵泡微環(huán)境分離，比體內(nèi)卵母細胞更容易受到外部環(huán)境變化的影響，這種脆弱性破壞了細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。 甘氨酸是谷胱甘肽（Glutathione, GSH）的主要成分之一，在體外保護豬卵母細胞方面發(fā)揮著重要作用。但甘氨酸的保護機制有待進一步闡明。本研究通過SMART-seq等技術確認甘氨酸是否可以調(diào)節(jié)ROS誘導的LPO，從而保護卵母細胞免受鐵死亡并促進卵母細胞在體外成熟。本研究將為預防和改善卵母細胞體外培養(yǎng)過程中的氧化損傷提供理論依據(jù)。 技術路線 主要研究內(nèi)容 1.甘氨酸處理對豬卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育的影響 與對照相比，甘氨酸處理顯著促進卵丘細胞擴散（圖1A），這一結果也通過卵丘細胞的擴散分析得到證實（圖1B）；如圖1C所示，甘氨酸處理還顯著降低了發(fā)育至MI期的卵母細胞比例，并促進了大多數(shù)卵母細胞發(fā)育至MII期，同時，甘氨酸組的卵裂率和囊胚率也顯著上調(diào)（圖1D）。綜上，甘氨酸處理促進豬卵母細胞的成熟和早期胚胎的發(fā)育。 圖1：甘氨酸處理對豬卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育的影響 2.甘氨酸對豬卵母細胞mRNA表達的影響 為了研究甘氨酸處理對豬卵母細胞質量影響的潛在機制，我們分析了對照組和甘氨酸組的轉錄組譜，并對豬卵母細胞進行RNA-seq檢測。如火山圖所示，甘氨酸組的卵母細胞與對照組的卵母細胞相比，共鑒定出15000個差異表達基因，其中有171個上調(diào)基因和153個下調(diào)基因（FC>2，P value<0.05）(圖2A)，并從中隨機選取了5個差異顯著的基因進行qPCR驗證，基因變化趨勢的一致性驗證了SMART-seq的準確性（圖2C.D）。GO富集分析表明，差異基因顯著富集到的條目大多與細胞成分有關，包括細胞核、膜、整體膜成分、膜結合細胞器、質膜和線粒體等（圖2B）。 圖2：甘氨酸對卵母細胞成熟影響的轉錄組分析 3.甘氨酸對卵母細胞LPO的影響 細胞內(nèi)ROS水平檢測結果顯示，甘氨酸治療組的ROS熒光強度明顯低于對照組（圖3B），此外MDA含量也明顯低于對照組（圖3C）。 圖3：甘氨酸對卵母細胞LPO的影響 4.甘氨酸對卵母細胞線粒體功能和過氧化物酶體的影響 本研究通過評估線粒體動力學，研究甘氨酸處理對卵母細胞成熟的影響。結果表明，甘氨酸補充組的線粒體熒光強度明顯高于對照組（圖4A），熒光強度分析也證實了這一結果。如圖4C所示，與對照組相比，補充甘氨酸后ATP熒光強度顯著上調(diào)。這些結果表明甘氨酸促進豬卵母細胞中線粒體功能的發(fā)育。 根據(jù)GO富集分析顯示，差異基因顯著富集在過氧化物酶體相關條目上。因此，通過免疫熒光染色檢測了重要指標PEX19和NRF2的蛋白表達，如圖5A和C所示，與對照組相比，甘氨酸組PEX19和NRF2的信號強度明顯增強。這些數(shù)據(jù)表明甘氨酸處理促進了豬卵母細胞的過氧化物酶體功能。 圖4：甘氨酸對卵母細胞線粒體功能的影響 圖5：甘氨酸對卵母細胞過氧化物酶體的影響 5.甘氨酸對卵母細胞脂質代謝的影響 本研究還通過BODIPY-LD（一種用于中性脂質的新型綠色熒光染料）證明了甘氨酸組卵母細胞的LDs水平也有明顯上升趨勢，這表明甘氨酸處理可以促進卵母細胞的脂質代謝(圖6)。 圖6：甘氨酸對卵母細胞脂質代謝的影響 6.甘氨酸對卵母細胞谷胱甘肽和鐵離子水平的影響 甘氨酸組中的卵母細胞產(chǎn)生非常強的GSH熒光信號，GSH熒光強度分析證實了這一發(fā)現(xiàn)（圖7B），抗氧化相關基因的表達趨勢也證實了結果（圖7C）；鐵積累的增加是誘導鐵死亡的關鍵，熒光強度實驗及鐵死亡相關基因的表達譜均證實了甘氨酸表達可以通過增加GSH水平來減少鐵死亡的發(fā)生（圖7D.E.F）。 圖7：甘氨酸對卵母細胞中GSH和鐵離子水平的影響 研究結論 本研究結果表明，補充甘氨酸促進了卵丘細胞的擴散和卵母細胞的成熟。卵母細胞發(fā)育能力檢測表明，補充甘氨酸顯著提高了體外受精（IVF）過程中的卵裂率和囊胚率；SMART-seq表明這種效應與甘氨酸介導的細胞膜結構和功能調(diào)節(jié)有關。外源添加甘氨酸，通過增強線粒體、過氧化物酶體和脂滴（LDs）的功能，減少活性氧（ROS）引起的脂質過氧化并降低丙二醛（MDA）的水平和脂質代謝相關因子水平，從而防止生物膜損傷并減少鐵死亡的發(fā)生以維持正常的卵母細胞發(fā)育功能。 本研究的轉錄組測序和部分數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。 文章二原文索引： Gao L, Zhang C, Zheng Y, et al. Glycine regulates lipid peroxidation promoting porcine oocyte maturation and early embryonic development[J]. Journal of Animal Science, 2023, 101: skac425.
