2023-03-14
《Nature Communications》
影響因子：17.694
文章題目：Oxidized mitochondrial DNA induces gasdermin D oligomerization in systemic lupus erythematosus 技術手段：RNA-Seq 上海交通大學醫學院瑞金醫院上海免疫研究所免疫相關疾病研究中心在《Nature Communications》上發表了氧化的線粒體DNA誘導系統性紅斑狼瘡中的GSDMD寡聚化的研究成果 。
研究背景 系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種異質性自身免疫性疾病，其特征是對核酸耐受性的破壞，導致周圍器官的系統性損害。在SLE中，細胞凋亡的異常調控在耐受失敗、自身免疫淋巴細胞激活和組織損傷中起關鍵作用。除了凋亡外，壞死性細胞死亡在SLE的起始和延續中也很重要。然而，SLE中的細胞焦亡（一種由Ggasdermin介導的程序性壞死細胞死亡）尚未得到證實。 Gasdermin D (GSDMD)是一種孔隙形成蛋白，在焦亡過程中起關鍵作用。但調節其活性的機制主要集中在調節其裂解的上游因子上，是否有其他因素促進GSDMD裂解后質膜上孔隙的形成尚不清楚。線粒體DNA 的失調與多種疾病有關。在SLE中，中性粒細胞mtDNA極易被mROS氧化并從線粒體中釋放。此外，mtDNA也可以被釋放到細胞外環境。細胞外mtDNA激活漿細胞樣樹突狀細胞并激活CD4+T細胞，這對SLE的發病至關重要。最近，mtDNA被鑒定為基因毒性脅迫下的細胞內第二信使。然而，mtDNA在mROS應激后在SLE中的作用尚不完全清楚。
技術路線
研究結果 1. GSDMD在SLE患者和狼瘡小鼠的中性粒細胞中被激活 GSDMD與caspase-1和caspase-4一起在狼瘡小鼠中顯著上調(圖1a)。狼瘡腎炎(LN)患者和小鼠狼瘡模型均檢測到腎小球中性粒細胞浸潤增加，其中這些中性粒細胞與固有腎細胞相比表現出更高水平的GSDMD表達(圖1b-i)。類似地，流式細胞分析揭示了SLE患者外周血中性粒細胞中GSDMD的細胞表面表達（圖1l, m）。與HV相比，SLE患者外周血中性粒細胞中GSDMD的mRNA表達增加（圖1n）。與HV相比，全長GSDMD表達水平增加，而GSDMD-N僅在SLE患者中檢測到（圖1o, p）。中性粒細胞中GSDMD-N的表達與血清mtDNA水平、SLE疾病活動指數（SLEDAI）、MPO-DNA復合物、彈性蛋白酶-DNA復合體呈正相關（圖1q, t）。這些結果表明GSDMD在狼瘡小鼠和SLE患者的中性粒細胞中被顯著激活，可能有助于NETs的產生和mtDNA的釋放。 圖1. GSDMD在狼瘡小鼠和SLE患者的中性粒細胞中被激活 2. 狼瘡樣小鼠腎臟GSDMD依賴性中性粒細胞死亡 PIL小鼠腎小球和腎小管間質組織中中性粒細胞浸潤顯著增加（圖2a, b）。降植烷處理的Ms4a3小鼠腎臟的免疫熒光染色證實約90%的浸潤性tdTomato+細胞是中性粒細胞（圖2c, d）。從tdTomato+細胞中發現染色的DNA以核分裂的形式釋放，隨后觀察到胞外釋放或網狀結構（（圖2e, 2f）。此外，在Gsdmd?/?狼瘡小鼠中，降植烷誘導的腎切片中Sytox Green陽性染色中性粒細胞顯著減少（圖2g），表明狼瘡小鼠中GSDMD依賴性細胞死亡。 圖2. 活體腎鏡檢查顯示活狼瘡小鼠中性粒細胞死亡 3. GSDMD孔允許從狼瘡中性粒細胞釋放DNA 中性粒細胞胞外DNA釋放在GSDMD抑制劑雙硫侖（DSF）治療后受到抑制（圖3a, b）。與LS加IFN-γ治療后的野生型（WT）小鼠相比，Gsdmd?/?小鼠骨髓中性粒細胞胞外DNA的釋放受到抑制（圖3c, d）。狼瘡血清或PMA治療后，Gsdmd?/?小鼠細胞中的中性粒細胞胞外DNA釋放顯著減少（圖3e）。這些數據表明，GSDMD對狼瘡血清治療后NET相關DNA釋放至關重要。 狼瘡血清加IFN-γ治療后，上清液中mtDNA和核DNA均隨時間增加。GSDMD敲除完全消除了mtDNA和核DNA的釋放（圖3f–i）。甘氨酸處理有效地防止了細胞裂解（圖3h–j）。然而，甘氨酸處理對LS加IFN-γ誘導的細胞外mtDNA釋放沒有顯著影響（圖3f, g）。 來自PIL小鼠的骨髓中性粒細胞顯示線粒體膜電位降低，而來自Gsdmd?/?小鼠的中性粒細胞則顯示超極化線粒體的百分比降低（圖3k, l）。這些數據表明GSDMD是溶解性NETs和非溶解性氧化mtDNA（Ox-mtDNA）釋放所必需的。 圖3. GSDMD是狼瘡血清治療后釋放NET相關DNA和mtDNA所必需的 4. GSDMD和mROS抑制劑抑制人中性粒細胞DNA釋放 用DSF、GSK484（PAD4抑制劑）和Mito-TEMPO處理后，細胞外DNA釋放受到抑制。然而，GSK484并沒有抑制Ox-mtDNA的釋放（圖4a，b）。GSK484沒有抑制培養基中DNA氧化和RNP ICs依賴的8OHdG釋放（圖4c）。LDG在體外培養6小時后自發釋放胞外DNA和Ox-mtDNA（圖4e）。DSF和Mito-TEMPO抑制了這些胞外DNA和mtDNA的釋放，而GSK484處理后釋放不受影響（圖4f）。總之，這些結果表明，在RNP ICs刺激的人類中性粒細胞和SLE患者的LDG中，mROS和GSDMD是Ox-mtDNA釋放所必需的。 圖4. mROS和GSDMD抑制顯著抑制了RNP ICs誘導的胞外mtDNA釋放 5. GSDMD-N通過FcγR/Serpinb1/caspase-1/11通路激活 從WT小鼠中分離出骨髓中性粒細胞，僅在LS加IFN-γ刺激后檢測到切割的GSDMD-N末端（圖5a, b）。caspase-1或caspase-11的單敲除足以部分減弱LS加IFN-γ治療后GSDMD的裂解，而在caspase-1/11雙敲除小鼠中幾乎沒有檢測到GSDMD-N（圖5e, f），IgG耗竭的狼瘡血清未能誘導caspase-1和?11的激活增加（圖5g, h）。此外，敲除FcγR抑制了caspase-1和?11的激活（圖5i, j）。在LS加IFN-γ刺激后，serpinb1的表達顯著下調；這種效應可以通過敲除FcγR 或者IgG耗竭來挽救（圖5g, i）。分離自SLE患者的外周血中性粒細胞中Serpinb1的表達幾乎完全消失，而caspase-1和?4被激活（圖5k, l）。數據表明ICs通過FcγR/Serpinb1/caspase-1, 11依賴性途徑促進GSDMD裂解。 圖5. 免疫復合物通過下調Serpinb1介導caspase-1和caspase-11的激活 6. Ox-mtDNA促進GSDMD-N寡聚化 GSDMD寡聚化可以在PIL小鼠的骨髓中性粒細胞和SLE患者的外周血中性粒細胞中檢測到（圖6a, d）。LS和IFN-γ刺激后，用Mito-TEMPO預處理小鼠中性粒細胞導致GSDMD寡聚體水平降低（圖6e, f），但GSDMD-N水平未受影響（圖6g, h）。在Ox-mtDNA處理后，GSDMD寡聚化顯著增加（圖6m, n）。此外，IMT1和CsA與VBIT-4均抑制GSDMD寡聚化（圖6q, r）。 圖6. 氧化mtDNA促進GSDMD寡聚化 7. Ox-mtDNA直接與GSDMD-N相互作用 與GSDMD的共免疫沉淀可以降低用LS和IFN-γ刺激的細胞裂解物中的mtDNA，表明GSDMD與mtDNA之間的直接相互作用（圖7a）。我們還檢測到SLE患者中性粒細胞中Ox-mtDNA和GSDMD的直接相互作用（圖7d, e）。MtDNA在全長或N端GSDMD轉染細胞的裂解物中檢測到（圖7f, g）。結果表明，GSDMD-N與mtDNA之間存在直接的相互作用。mtDNA可以與純化的GSDMD蛋白相互作用，Kd為1.3μM（圖7j，k）。GSDMD-N可以與Ox-mtDNA相互作用，Kd為239nM（圖7l, m）。這些結果表明Ox-mtDNA可以與GSDMD-N兩親性α-螺旋中的四個帶正電荷的殘基直接相互作用。 圖7. MtDNA直接與GSDMD-N相互作用 8. GSDMD缺乏導致狼瘡模型疾病活動性降低 WT和Gsdmd?/?小鼠腎臟組織的RNA-seq分析顯示，與促炎細胞因子產生或I型IFN信號傳導相關的基因在降植烷治療的Gsdmd?/?小鼠中受到抑制（圖8a）。GO富集與白細胞活化、先天免疫應答、細胞因子產生的調節和免疫應答有關（圖8b）。GSEA顯示IFN途徑和炎癥反應顯著富集（圖8c）。與這些發現一致，在降植烷治療后，Gsdmd?/?小鼠的血清IFN-α和IL-1β水平降低（圖8d, e）。在降植烷治療七個月后，WT小鼠存在嚴重的增殖性腎小球腎炎，而Gsdmd?/?小鼠得到了緩解（圖8h）。中性粒細胞中的GSDMD條件敲除抑制了降植烷治療后血清IFN-α和IL-1β水平（圖8k, l）。 圖8. GSDMD缺乏顯著降低了PIL小鼠的疾病活性 9. GSDMD的藥理學抑制減輕狼瘡疾病活性 DSF治療后，MRL/lpr小鼠脾臟和淋巴結重量的增加顯著受到抑制（圖9a-d）。MRL/lpr小鼠中抗dsDNA、抗RNPs和抗Sm（圖9e-g）自身抗體水平降低。血清IL-1β、IL-18和mtDNA水平也降低（圖9h-j）。腎功能在DSF治療后得到改善（圖9m）。DSF治療還減少了ICs的腎沉積（圖9n-p）。這些數據表明，DSF介導的GSDMD抑制足以延緩MRL/lpr小鼠的疾病進展。 總之，SLE患者血清中的ICs和IFN-γ通過serpinb1/caspase-1/11通路促進GSDMD的激活。同時，ICs還促進線粒體應激，這有助于Ox-mtDNA釋放到胞漿中。胞漿Ox-mtDNA直接與GSDMD-N結合，以促進GSDMD-N寡聚化和GSDMD孔形成。最后，NETs和mtDNA的胞外釋放促進SLE發病（圖9q）。 圖9. GSDMD抑制減輕MRL/lpr小鼠的疾病活性 
結 論 在SLE患者血清和IFN-γ體外刺激后，中性粒細胞釋放核DNA和線粒體DNA以及溶解性細胞死亡所需的成孔蛋白GSDMD。從機制上講，SLE患者血清體外刺激后，FcγR的激活下調了SeRpinb1，導致caspase-1/caspase-11的自發激活和GSDMD裂解為GSDMD-N。此外，mtDNA氧化促進了GSDMD-N寡聚化和細胞死亡。此外，GSDMD是SLE患者和健康人中性粒細胞與ICs孵育后從低密度粒細胞釋放細胞外mtDNA所必需的。使用降植烷誘導的狼瘡模型，我們發現中性粒細胞特異性Gsdmd缺乏癥小鼠或Gsdmd抑制劑雙硫侖治療后，疾病嚴重程度顯著降低。總之，我們的研究強調了氧化mtDNA在誘導GSDMD寡聚化和孔形成中的重要作用。這些發現也表明GSDMD可能是SLE的一個可能的治療靶點。
本研究的轉錄組測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引： Miao N, Wang Z, Wang Q, Xie H, Yang N, Wang Y, Wang J, Kang H, Bai W, Wang Y, He R, Yan K, Wang Y, Hu Q, Liu Z, Li F, Wang F, Ginhoux F, Zhang X, Yin J, Lu L, Wang J. Oxidized mitochondrial DNA induces gasdermin D oligomerization in systemic lupus erythematosus. Nat Commun. 2023 Feb 16;14(1):872. doi: 10.1038/s41467-023-36522-z.
