2023-02-20
《Green Chemistry》
影響因子：11.034
前言 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院在國際知名期刊《Green Chemistry》發(fā)表新研究成果！本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的HMF（1,2 5-羥甲基糠醛）高度耐受菌Enterobacter ludwigii YYP3，作為一種全細(xì)胞生物催化劑，能將HMF有效還原為2,5-雙（羥甲基）呋喃（BHMF），證實(shí)了該菌株在BHMF的大規(guī)模生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景，而且為理解HMF還原的分子機(jī)制提供了新的見解。
01、研究背景 BHMF的脂肪酸二酯由于其高能量密度和在柴油中的優(yōu)異混溶性而被認(rèn)為是一類新的生物柴油添加劑。目前，化學(xué)方法仍是HMF合成BHMF的主要方法，相比之下，生物催化還原HMF，因其環(huán)境友好的反應(yīng)條件、高催化效率和可選擇性而被視為綠色和有前途的替代品。許多其他報(bào)道的全細(xì)胞生物催化劑中的目標(biāo)酶仍然未知。更重要的是，對(duì)這些靶酶介導(dǎo)的HMF到BHMF轉(zhuǎn)化的催化機(jī)制知之甚少。 本研究經(jīng)過對(duì)Enterobacter ludwigii YYP3菌全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序分析，揭示了生物催化劑耐受的分子機(jī)制，并鑒定了兩種在HMF還原中起關(guān)鍵作用的新型短鏈脫氫酶/還原酶（SDR）氧化還原酶。通過結(jié)構(gòu)和突變分析，揭示了HMF還原BHMF的催化機(jī)理。本研究報(bào)告的進(jìn)展將為HMF向BHMF的大規(guī)模全細(xì)胞介導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
02、研究材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)材料：從化學(xué)工業(yè)土壤中分離得到的一株能夠有效將HMF轉(zhuǎn)化成BHMF的細(xì)菌YYP3，經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)其為Enterobacter ludwigii。 2.測序平臺(tái)：Illumina、PacBio 3.分析內(nèi)容：催化效率檢測、16S進(jìn)化樹構(gòu)建、細(xì)菌完成圖測序分析、轉(zhuǎn)錄組測序分析、蛋白結(jié)構(gòu)分析等。
03、研究結(jié)果 E.Ludwigii YYP3對(duì)HMF生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化 從土壤樣品中分離出了E.ludwigii YYP3，該細(xì)菌僅在1.5小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化了88.1%的HMF，對(duì)還原產(chǎn)物BHMF的選擇性為85%，以及少量HMFCA（15%），表明對(duì)HMF具有強(qiáng)大的還原活性。優(yōu)化后，在最佳反應(yīng)條件下，E.ludwigii YYP3僅用了3小時(shí)就完全轉(zhuǎn)化了100 mM HMF，BHMF產(chǎn)率高（>99%），選擇性高（98.5%），在目前報(bào)道的全細(xì)胞生物催化劑中獲得了最高的時(shí)空產(chǎn)率（4.2 g.L?1 h?1）。本研究中由E.ludwigii YYP3介導(dǎo)的生物催化過程已成為HMF綠色和清潔增值轉(zhuǎn)化的化學(xué)方法的一種有前途的替代方法，因?yàn)榉磻?yīng)可以在溫和的條件下進(jìn)行，具有優(yōu)異的選擇性和高的時(shí)空產(chǎn)率。 圖１最佳條件下生物合成BHMF的典型過程曲線 E. ludwigii YYP3轉(zhuǎn)錄組測序分析 E.ludwigiiYYP3的優(yōu)異性能迫使我們通過全基因組進(jìn)一步研究其潛在的抗性機(jī)制，特別是負(fù)責(zé)HMF減少的靶酶。E.ludwigii YYP3的全基因組具有單個(gè)圓形染色體，其中包含4 845 702個(gè)堿基，G+C含量為54.54%，注釋了4551個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列、25個(gè)rRNA、84個(gè)tRNA和107個(gè)ncRNA。總的來說，在全基因組中成功注釋了4502個(gè)單基因，NR、COG、KEGG、Swiss Prot、GO、TCDB、Pfam和PHI數(shù)據(jù)庫分別注釋了4499、4276、3031、3941、3641、1194、4008和1191個(gè)基因。通過BLAST軟件對(duì)照COG數(shù)據(jù)庫確定基因組功能注釋，并使用GO數(shù)據(jù)庫鑒定了分子功能、細(xì)胞成分和生物過程的富集分析。 圖2 基因組圈圖 E. ludwigii YYP3轉(zhuǎn)錄組測序分析 分析了暴露于或不暴露于HMF底物（100mM）的E.ludwigii YYP3的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)4508個(gè)基因在對(duì)照組和HMF組之間顯示出不同的表達(dá)水平。在log2|fold change|>1和P值<0.05的條件下，發(fā)現(xiàn)315個(gè)基因上調(diào)，111個(gè)基因下調(diào)。根據(jù)GO富集分析，差異表達(dá)基因主要與生物過程和分子功能相關(guān)，包括核酸結(jié)合（114個(gè)上調(diào)基因和19個(gè)下調(diào)基因）、生物膜形成（17個(gè)上調(diào)基因）、細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)（20個(gè)上調(diào)基因和2個(gè)下調(diào)基因）和氨基酸生物合成和代謝過程（5個(gè)上調(diào)基因，81個(gè)下調(diào)基因）。 圖3 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果 快速鑒定負(fù)責(zé)HMF還原的目標(biāo)酶 先前已證明，具有氧化還原活性的酶最可能是這些有毒醛類還原的原因。RNA-seq發(fā)現(xiàn)10個(gè)編碼氧化還原酶的基因在HMF實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)，推測為HMF還原的可能候選酶。異源表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有SDR家族氧化還原酶編碼基因（ykvO和SSP1627）的重組菌株能夠在50mM底物濃度下在3小時(shí)內(nèi)將HMF高效轉(zhuǎn)化為BHMF。有趣的是，這兩種重組菌株的催化效率低于野生菌株，這可能是因?yàn)檫@些負(fù)責(zé)呋喃醛轉(zhuǎn)化的還原酶通常是NAD（P）H依賴性的，輔因子再生也是反應(yīng)中的障礙。因此，還原酶和NAD（P）H再生酶的共表達(dá)通常是必要的。 圖4 BHMF轉(zhuǎn)化效率 SDR家族氧化還原酶結(jié)構(gòu)特征 為了進(jìn)一步研究氧化還原酶對(duì)HMF還原的催化機(jī)制，分析了研究報(bào)告中的三種酶（CmCR、MgAAD1669、AspRedAm）以及兩種SDR（ElSDR-ykvO和ElSDR-SSP1627）的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)。它們之間最大的構(gòu)象差異是活動(dòng)袋頂部的蓋區(qū)。在ElSDR-ykvO和ElSDR-SSP1627中，有一個(gè)無序的長環(huán)屏蔽活性位點(diǎn)，而在CmCR中有一個(gè)短環(huán)和α-螺旋保持活性位點(diǎn)相對(duì)開放。分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，ElSDR-ykvO和ElSDR-SSP1627蓋區(qū)的RMSF值明顯高于CmCR，這意味著更大的靈活性。因此，綜合上述結(jié)果，兩種SDR和CmCR蓋區(qū)的結(jié)構(gòu)和柔性差異可能會(huì)對(duì)其從HMF到BHMF的還原活性產(chǎn)生很大影響。 圖5 ElSDR-SSP1627、ElSDR-ykvO和CmCR與SDR家族醇脫氫酶RasADH的序列比對(duì)及蛋白結(jié)構(gòu) SDR家族氧化還原酶還原HMF的催化機(jī)理 袋狀結(jié)構(gòu)特征分析表明：HMF和NADPH的煙酰胺和腺嘌呤部分占據(jù)了空腔的疏水區(qū)域，而NADPH的二核苷酸和磷酸部分位于空腔的親水區(qū)域內(nèi)。分子對(duì)接結(jié)果表明，HMF的羰基氧與S143和Y156的羥基之間形成了兩對(duì)氫鍵相互作用。共底物NADPH通過與許多周圍氨基酸殘基的氫鍵相互作用（16個(gè)氫鍵）而大大穩(wěn)定。結(jié)合以上結(jié)果，我們推測ElSDR-SSP1627介導(dǎo)的HMF還原的催化機(jī)制也基于HMF還原中的活性位點(diǎn)Ser、Tyr和Lys。由于ElSDR-ykvO、ElSDR-SSP1627和CmCR具有相似的結(jié)構(gòu)和催化中心，我們認(rèn)為與HMF還原相關(guān)的SDR可能共享這種催化機(jī)制。 圖6 ElSDR-SSP1627與HMF（黃色）和NADPH的分子對(duì)接結(jié)果
04、研究結(jié)論 在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)了一種新型的全細(xì)胞生物催化劑E.ludwigii YYP3，在從HMF合成BHMF中表現(xiàn)出優(yōu)異的催化效率和循環(huán)穩(wěn)定性。經(jīng)過細(xì)菌全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，揭示了HMF耐受的分子機(jī)制。同時(shí)，兩種新的SDR家族氧化還原酶，ElSDR-ykvO和ElSDR-SSP1627，被鑒定用于將HMF轉(zhuǎn)化為毒性較小的BHMF，其催化機(jī)制被認(rèn)為是基于活性位點(diǎn)Ser、Tyr和Lys。了解這些機(jī)制將有助于我們通過代謝工程和合成生物學(xué)進(jìn)一步提高全細(xì)胞生物催化劑的催化性能。
本研究的細(xì)菌完成圖和轉(zhuǎn)錄組測序及分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進(jìn)一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：021-80118168-8617）！
文章索引：Pan X., Wang X., Wu S.H., et al. (2022).Insights into the molecular mechanism of a new effiffifficient whole-cell biocatalyst Enterobacter ludwigii YYP3 in 5-hydroxymethylfurfural reduction.Green Chemistry. DOI: 10.1039/d2gc01967arsc.li/greenchem.
