文章題目：Glycine ameliorates MBP-induced meiotic abnormalities and apoptosis by regulating mitochondrial-endoplasmic reticulum interactions in porcine oocytes
吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)李所團(tuán)隊(duì)在Environmental Pollution上發(fā)表甘氨酸通過(guò)調(diào)節(jié)豬卵母細(xì)胞線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用改善MBP誘導(dǎo)的減數(shù)分裂異常和凋亡研究的成果。
鄰苯二甲酸單丁酯 (MBP) 是鄰苯二甲酸二丁酯 (DBP) 在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物。MBP具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可以在生物體中持續(xù)積累，并有可能損害動(dòng)物和人類的生殖功能。在卵巢卵泡微環(huán)境中，DBP及其代謝物MBP可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育和類固醇生成的缺陷，減數(shù)分裂成熟異常，卵巢功能受損和其他生殖缺陷。以前的研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸 (Gly) 似乎能夠保護(hù)卵母細(xì)胞免受MBP誘導(dǎo)的損傷。在這項(xiàng)研究中，SMART-seq于研究MBP暴露對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟 (IVM) 和發(fā)育的影響。闡明MBP對(duì)卵母細(xì)胞毒性作用的潛在機(jī)制，并探索Gly改善MBP誘導(dǎo)的豬卵母細(xì)胞損傷的機(jī)制。
NO.3、研究?jī)?nèi)容
1、MBP對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟和ROS水平的影響
首先，用不同MBP濃度 (25 μm、50 μm、100 μm和200 μm)處理卵母細(xì)胞，評(píng)估MBP對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的影響。與對(duì)照組相比，MBP組中的卵丘細(xì)胞部分?jǐn)U張或未擴(kuò)張。對(duì)照組中的大多數(shù)卵母細(xì)胞已擠出第一極體 (PBI)，而大部分卵母細(xì)胞在MBP處理后未能擠出PBI。MBP處理組的PBI擠出速率以劑量依賴性方式顯著降低。也評(píng)估了卵母細(xì)胞成熟和死亡率。用ROS熒光強(qiáng)度評(píng)估MBP暴露是否導(dǎo)致氧化應(yīng)激，在MBP暴露后ROS熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，結(jié)果表明卵母細(xì)胞經(jīng)歷了氧化應(yīng)激損傷。
圖1. MBP暴露對(duì)豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的影響
3.2 MBP對(duì)豬卵母細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響
為了研究MBP暴露對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響，進(jìn)行了RNA-seq。在培養(yǎng)42小時(shí)后，MBP暴露組與對(duì)照組相比有149個(gè)基因的表達(dá)有顯著差異，92個(gè)上調(diào)的基因和57個(gè)下調(diào)的基因 (padj <0.05，fold change > 2) (圖2A)。對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果表明，MBP暴露后差異表達(dá)的基因在生物過(guò)程細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞質(zhì)微核中顯著富集。顯著富集的細(xì)胞成分包括ER伴侶復(fù)合物、線粒體外膜和線粒體軟骨 (圖2C)。這些結(jié)果提供了關(guān)于MBP對(duì)豬卵細(xì)胞質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響的功能途徑。
圖2.轉(zhuǎn)錄組分析評(píng)估MBP暴露對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響
3.3 Gly對(duì)暴露于MBP的卵母細(xì)胞的影響
為了評(píng)估Gly對(duì)MBP暴露后卵母細(xì)胞成熟的影響。觀察了紡錘體形態(tài)，驗(yàn)證了CDC26 (中/晚期有絲分裂轉(zhuǎn)變調(diào)節(jié)因子) mRNA表達(dá)的變化（圖3）。表明Gly改善了MBP誘導(dǎo)的豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂異常。
聚類分析表明，在MBP暴露后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶復(fù)合物、線粒體外膜、線粒體和其他細(xì)胞成分顯著富集 (圖4A)。在物理?xiàng)l件下，ER通過(guò)線粒體相關(guān)的ER膜 (MAM) 與線粒體相互作用。因此，使用Mander系數(shù)評(píng)估了ER膜(MAM)與線粒體之間的相互作用程度。結(jié)果表明MBP增加了線粒體與ER之間的相互作用，Gly可以減少M(fèi)BP誘導(dǎo)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互作用。通過(guò)分析MFN1和MFN2的蛋白表達(dá)、相對(duì)熒光強(qiáng)度以及基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Gly可能通過(guò)保護(hù)MFN1和MFN2的表達(dá)來(lái)減輕MBP誘導(dǎo)的ER與線粒體之間的相互作用。
ER和線粒體之間相互作用的增強(qiáng)導(dǎo)致兩個(gè)細(xì)胞器之間的鈣轉(zhuǎn)移增強(qiáng)，因此測(cè)量了MBP暴露后的豬卵母細(xì)胞的鈣離子水平，包括 [Ca2+]i，[Ca2+ ]ER和 [Ca2+]m。與對(duì)照組相比，單獨(dú)用Gly治療的組的[Ca2+]i水平降低，而MBP組的[Ca2+]i水平明顯高于其他組，Gly治療顯著降低 [Ca2+]i水平 (圖5B)。用特定探針對(duì)ER和線粒體進(jìn)行染色，以評(píng)估細(xì)胞內(nèi)鈣離子的總體動(dòng)態(tài)平衡。結(jié)果表明，[Ca2+]m水平的變化趨勢(shì)與四組[Ca2+]i水平的變化趨勢(shì)相同。(圖6D)。我們檢查了[Ca2+ ]ER水平的趨勢(shì)，MBP暴露組[Ca2+ ]ER水平顯著降低，而Gly治療組的 [Ca2+ ]ER水平明顯高于MBP組 (圖5C)。
ROS和GSH的水平是氧化和抗氧化應(yīng)激的主要指標(biāo)。分析了ROS和GSH熒光強(qiáng)度，還分析了幾種氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。MBP暴露顯著上調(diào)MDA mRNA表達(dá)，Gly治療后下調(diào)了MDA mRNA的表達(dá)；MBP暴露顯著下調(diào)了CAT的mRNA表達(dá)，Gly治療后使CAT的mRNA表達(dá)恢復(fù)至正常水平（圖6)，結(jié)果表明，Gly可以保護(hù)卵母細(xì)胞免受MBP暴露引起的氧化應(yīng)激。
氧化應(yīng)激通常誘導(dǎo)凋亡。聚類分析表明，幾個(gè)重要的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào) (圖7A)。為了研究MBP處理是否會(huì)導(dǎo)致豬卵母細(xì)胞的早期凋亡，對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行了Annexin V和Caspase3染色 (圖7C和D)，還分析了幾個(gè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，MBP暴露后BAX和Caspase 3表達(dá)增加、差異表達(dá)基因AIFM1表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明，Gly對(duì)MBP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。
圖3.Gly對(duì)暴露于MBP的卵母細(xì)胞紡錘體形態(tài)的影響
圖4.Gly對(duì)MBP暴露卵母細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位的影響
圖5.Gly對(duì)用MBP處理的豬卵母細(xì)胞中Ca2+水平的影響
圖6.Gly對(duì)MBP暴露卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
圖7. Gly改善了MBP暴露對(duì)豬卵母細(xì)胞凋亡的影響
該結(jié)果證實(shí)了Gly對(duì)MBP誘導(dǎo)的豬卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成熟受損具有保護(hù)作用。從細(xì)胞器的角度，本研究揭示Gly可以通過(guò)降低MFN1和MFN2的表達(dá)，進(jìn)一步降低 [Ca2+ ]m的水平來(lái)調(diào)節(jié)MAM相互作用，從而改善卵母細(xì)胞線粒體功能，降低ROS水平和卵母細(xì)胞凋亡，并減輕MBP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和細(xì)胞骨架異常的毒性作用。這些結(jié)果有助于我們理解MBP影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的毒理學(xué)機(jī)制，并且Gly可以潛在地用于防止MBP誘導(dǎo)的來(lái)自人類或其他用于胚胎工程技術(shù)的動(dòng)物物種的卵母細(xì)胞中的缺陷。
本研究的RNA-seq部分工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引：Gao, L., Zhang, C., Yu, S., Liu, S., Wang, G., Lan, H., Zheng, X., & Li, S. (2022). Environmental pollution glycine ameliorates MBP-induced meiotic abnormalities and apoptosis by regulating mitochondrial-endoplasmic reticulum interactions in porcine oocytes. Environmental pollution, 119756 .
