2023-02-07
《ACS Nano》
影響因子：18.027
廣東省科學院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所在《ACS Nano》上發(fā)表了轉錄組分析揭示黑鱗納米誘導腸道致病性大腸桿菌促進生長機制的研究成果。
研究背景
作為二維（2D）納米材料的一員，黑鱗（BP）納米片在環(huán)境修復方面表現(xiàn)出卓越的性能。隨著黑鱗納米片的推廣與應用，將不可避免地影響各類環(huán)境中的微生物。雖然BP納米片的細菌毒性已被證實，但其對病原性和非病原性微生物菌株中的生物反應是否不同尚不清楚。
考慮到致病菌在環(huán)境中也廣泛存在并可直接導致人類和其他動物患病，故本研究擬通過轉錄組測序分析，蛋白組分析，并結合多種生物學技術，揭示BP納米片促進致病性大腸桿菌(EPEC)生長的機制，以評估BP納米片對環(huán)境和人類健康的潛在風險。
技術路線
主要研究結果
BP 納米片對細菌生長的影響
生長曲線測量表明，BP納米片對非致病菌大腸桿菌DH5α和大腸桿菌k12沒有顯著影響，在濃度為50和100 μg·mL ?1的BP納米片處理下，其對非致病菌芽孢桿菌有顯著的生長抑制作用；相反，濃度為50和100 μg·mL ?1的 BP 納米片在12小時內分別促進致病性大腸桿菌EPEC的生長31.06%和45.55%（圖1a-h）。通過菌落計數(shù)法確定的細菌活力與生長曲線的結果一致，BP納米片對大腸桿菌DH5α和大腸桿菌k12的活力沒有顯著影響，但能顯著提高EPEC的活力，并顯著抑制芽孢桿菌的生存能力(圖1i-l)。
圖1：BP納米片對細菌的生長影響
轉錄組測序分析及qPCR驗證
本研究為了進一步探知BP納米片對環(huán)境微生物的影響，選取3個非致病菌和1個致病菌進行了轉錄組測序。分析表明代謝和跨膜轉運相關通路中起作用的差異表達基因(DEGs)在EPECBP10和EPECBP100中顯著上調，相比較于非致病性菌（DH5αBP100，k12BP100和B. tropicusBP100），新陳代謝相關代謝通路的DEGs在EPECBP100和EPECBP10中更多。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證，結果表明在EPECBP100和EPECBP10中絕大多數(shù)基因表達趨勢與轉錄組一致，在DH5αBP100，k12BP100和B. tropicus BP100中也表現(xiàn)出大部分基因的表達趨勢在qRT-PCR和轉錄組測序之間沒有差異。
圖2：qRT-PCR和轉錄組之間的基因表達數(shù)據(jù)比較
代謝通路富集分析
在BP納米片處理的12小時后，共檢測出158個（EPECBP10）和221個（EPECBP100）與代謝途徑相關的重要DEGs。在這兩個不同BP濃度下，能量代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝是主要的富集通路，其中氮代謝（ko00910）是能量代謝中顯著富集的通路，表現(xiàn)為以濃度依賴性方式顯著上調（圖3）；除了氮代謝，EPEC中的一系列氨基酸代謝途徑也受到BP納米片的影響（圖4），協(xié)同促進了 EPEC 中谷氨酸的積累。通過二喹啉甲酸測定，蛋白質測定，凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白組分析證實了BP納米片可通過上調谷氨酰胺的產(chǎn)生來促進EPEC中的蛋白質合成。
圖3：BP納米片對EPEC中氮代謝的調節(jié)
圖4：BP納米片對EPEC中精氨酸生物合成和脯氨酸代謝的調節(jié)
BP納米片對抗氧化應激反應的影響
EPEC作為致病菌已被證明可以調節(jié)廣泛生物途徑來以抵抗和適應BP納米片帶來的毒性。轉錄組分析表明，抗壞血酸和醛糖酸代謝 (ko00053)在EPECBP100中顯著富集，這可能會加速抗壞血酸的生物合成并進一步激活抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（ASA-GSH循環(huán)）。ASA-GSH 循環(huán)被認為是氧化應激下ROS 清除的重要系統(tǒng)。為了驗證轉錄組分析，作者監(jiān)測了不同菌株的細胞內ROS（圖5），結果表明在EPEC中激活了一系列信號通路，以抵消BP納米片暴露下ROS的產(chǎn)生，而并未明顯增強非致病菌株的ROS清除能力。這證實了EPEC通過在BP處理后激活抗氧化系統(tǒng)來耐受氧化應激。
圖5：細菌定量熒光強度
BP納米片對膜損傷的影響
相較三個非致病菌(大腸桿菌DH5α，大腸桿菌k12和芽孢桿菌)，EPEC通過調節(jié)ompA、slp、ompC和ompF等關鍵外膜蛋白相關基因來維膜穩(wěn)定性和確保細菌外膜功能（圖6），并通過掃描電鏡（SEM）證實了在BP納米片脅迫下與非致病性菌株不同，大多數(shù)EPEC細胞能保持其形態(tài)和膜完整性（圖7）。
圖6：外膜蛋白相關基因表達熱圖
圖7：BP脅迫下細菌的膜損傷
研究結論
本研究證明了非致病菌株（大腸桿菌DH5α，大腸桿菌k12和雙歧桿菌）和致病菌EPEC對BP納米片脅迫的不同細胞反應，并描述了導致轉錄組水平變化的分子機制。本研究還表明，納米材料的菌株依賴性微生物效應可能非常重要，并強調了評估新興納米材料的危害和毒性時模型菌株選擇的重要性。
本研究的轉錄組測序和部分數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
