2023-01-17
《Science of the Total Environment》
影響因子
10.753
文章題目：Geosmin disrupts energy metabolism and locomotor behavior of zebrafish in early life stages 中國科學(xué)院水生生物研究所在《Science of the Total Environment》上發(fā)表了土臭素導(dǎo)致斑馬魚線粒體應(yīng)激進而影響能量代謝潛在機制的新見解。
研究背景 土臭素（geosmin）是一種土腥味/土霉味的氣味物質(zhì)，由藍藻、真菌、細菌和高等植物產(chǎn)生。土臭素在各種水生環(huán)境和生物群中都被普遍檢測到，但其對生物體的確切毒理學(xué)機制需要進一步的實驗。基于先前的研究結(jié)果，作者假設(shè)土臭素干擾了斑馬魚胚胎線粒體中的電子運輸鏈和ATP合成，導(dǎo)致能量代謝進一步受損。因此將斑馬魚胚胎受精（hpf）后暴露于不同濃度的土臭素中，隨后進行運動活性和生化參數(shù)檢測以及轉(zhuǎn)錄組和代謝組的多組學(xué)研究以共同解析土臭素調(diào)控水生生物的能量代謝和運動行為的潛在機制。
技術(shù)路線
研究內(nèi)容 斑馬魚暴露溶液中土臭素的濃度 在0和12小時測量暴露溶液中的土臭素濃度，以確定實際暴露濃度。對照（SC）組中的土臭素濃度低于檢測限（LOD）。50、500和5000 ng/L暴露組中的土臭素濃度在12小時后分別下降了54%、35.7%和25.3%（圖1A）。因此，在50、500和5000 ng/L暴露組中，實際暴露濃度的幾何平均值分別為35.3、395.8和4139.3 ng/L。 據(jù)報道，不同水生生物中存在土霉素的生物累積。在該研究中，395.8和4139.3 ng/L的暴露組中，斑馬魚幼蟲中的土臭素濃度分別為1.5和21.5μg/kg（圖1B）。SC組和35.3 ng/L組中的土霉素濃度低于檢測限。魚類中的這些濃度與之前在紅羅非魚中發(fā)現(xiàn)的濃度相當(dāng)，這表明由于土臭素的污染，可能對自然環(huán)境中的魚類產(chǎn)生不利影響。 圖1 暴露溶液和斑馬魚幼蟲中土臭素的濃度 土臭素暴露誘導(dǎo)斑馬魚幼蟲的低活性 我們將斑馬魚胚胎在受精（hpf）后120小時內(nèi)暴露于標(biāo)稱濃度為50、500和5000 ng/L的土臭素中，隨后進行運動活性檢測。發(fā)現(xiàn)斑馬魚幼蟲在黑暗期的速度和總距離顯著降低（圖2A-C）。這些數(shù)據(jù)表明，在斑馬魚的早期階段，暴露于土臭素會導(dǎo)致其活性低下。而先前的研究表明土臭素在魚類中引起的行為反應(yīng)似乎是劑量和物種依賴性的，因此需要進行額外的工作來了解土臭素對運動活性的影響。 圖2 暴露于土臭素的斑馬魚幼蟲的運動行為 暴露于土臭素的斑馬魚的轉(zhuǎn)錄組概述 為了了解運動受損的分子機制，我們分析了轉(zhuǎn)錄組特征。與SC組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相比（圖3A），395.8 ng/L和4139.3 ng/L暴露組中分別發(fā)現(xiàn)801個DEG（409個上調(diào)和392個下調(diào)）和826個DEG（359個上調(diào)和467個下調(diào)）。Venn分析結(jié)果顯示，395.8 ng/L和4139.3 ng/L暴露組中分別檢測到121個共上調(diào)（圖3B）和144個共下調(diào)（圖3C）DEG。這些共DEG出現(xiàn)在不同的治療組中，反映了暴露于土霉素后基因反應(yīng)的一致性。主成分分析（PCA）發(fā)現(xiàn)，每一組都表現(xiàn)出可區(qū)分的分布（圖3D）。在各種土臭素處理組的DEG熱圖中也檢測到類似的結(jié)果（圖3E）。 圖3土臭素誘導(dǎo)斑馬魚幼蟲轉(zhuǎn)錄譜的變化 我們通過GO條目和KEGG代謝通路富集分析探討了基因表達變化的生物學(xué)意義，以獲得土霉素暴露的生物學(xué)效應(yīng)概述。GO富集結(jié)果表明，糖酵解、氧化磷酸化相關(guān)條目（線粒體內(nèi)膜、線粒體、呼吸鏈和電子運輸）、脂質(zhì)代謝、蛋白水解和核受體是暴露于土臭素后最受影響的途徑（圖4A-B）。此外，包括雷帕霉素（mTOR）信號通路、氧化磷酸化（OXPHOS）、核糖體、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、TGF-β信號通路、細胞周期和甘油脂代謝在內(nèi)的七種KEGG代謝通路在395.8和4139.3 ng/L土臭素暴露組中顯著富集（圖4C和D）。 圖4 不同濃度土臭素暴露組GO和KEGG富集分析 土臭素引起能量代謝相關(guān)基因的改變 395.8和4139.3 ng/L土臭素暴露均顯著改變了與能量代謝例如參與糖酵解、三羧酸（TCA）循環(huán)、OXPHOS和脂質(zhì)代謝等的相關(guān)基因。糖酵解代謝信號需要三種限速酶，己糖激酶（HK）、6-磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK），以維持正常的代謝活動并有效產(chǎn)生能量ATP。在這項研究中，在4139.3 ng/L 土臭素暴露組中，hk1和pklr的表達水平顯著上調(diào)。然而，作為糖酵解代謝途徑中的第二步限速酶，pfkfb3和pfkfb4b在395.8和4139.3 ng/L 土臭素暴露組中表現(xiàn)出顯著降低。因此，急性暴露于土臭素可能會導(dǎo)致斑馬魚糖酵解紊亂。此外，我們發(fā)現(xiàn)編碼調(diào)節(jié)丙酮酸代謝的酶的mRNA水平降低，包括丙酮酸脫氫酶（PDH）和丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）。值得注意的是，37個改變的基因與氧化磷酸化相關(guān)（圖5），因此暴露于土臭素在轉(zhuǎn)錄水平上會影響線粒體功能。 本研究中crata和cpt2的下調(diào)表達（圖5）表明，土臭素可以減少斑馬魚中脂肪酸作為燃料的使用。極長鏈脂肪酸蛋白（ELOVL）或脂肪酸長鏈酶的伸長是負責(zé)長鏈脂肪脂肪酸生物合成的起始酶和限速酶。值得注意的是，4139.3 ng/L土臭素暴露組中ELOVL家族的兩個成員（elovl1a和elovl6l）表現(xiàn)出顯著的下調(diào)（圖5）。總之，這些結(jié)果表明，脂質(zhì)代謝可能是土臭素暴露的另一個重要毒性靶點。 圖5 與能量代謝和轉(zhuǎn)錄組變化熱圖相關(guān)的途徑 土臭素對斑馬魚線粒體呼吸的影響 在這項研究中，線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、II、III、IV和V的活性使用酶聯(lián)測定法測定。如圖6A-E所示，復(fù)合物I-V的活性在395.8 ng/L和4139.3 ng/L土臭素暴露組中顯著降低（p<0.05）。此外，土臭素暴露組中的ATP含量顯著降低（p<0.05）。因此，我們推測土臭素誘導(dǎo)的運動行為變化可能與線粒體功能障礙有關(guān)。 圖6 線粒體呼吸鏈復(fù)合物I（A）、II（B）、III（C）、IV（D）和V（E）的酶活性測定 為了進一步證實這一推測，我們通過測量24 hpf時斑馬魚胚胎的耗氧率（OCR）進行了線粒體應(yīng)激試驗（圖7）。值得注意的是，395.8 ng/L土臭素暴露組的基礎(chǔ)呼吸、非線粒體呼吸和ATP產(chǎn)生（或ATP相關(guān)呼吸）顯著降低。此外，在35.3 ng/L 土臭素暴露后，觀察到質(zhì)子泄漏顯著減少。35.3和395.8 ng/L 土臭素暴露組在24 hpf時顯示最大呼吸減少，但這與SC組沒有顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)表明，土臭素通過調(diào)節(jié)代謝潛力對線粒體功能產(chǎn)生不利影響。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)土臭素對線粒體功能障礙的劑量反應(yīng)關(guān)系不是線性的，而是U形的，這可能解釋了斑馬魚即使在較低濃度的土臭素（35.3 ng/L）下的異常行為。然而，暴露于4139.3 ng/L 土臭素的斑馬魚胚胎的線粒體呼吸相關(guān)終點沒有改變。需要注意的一點是，由于線粒體生物發(fā)生，氧消耗可能會根據(jù)斑馬魚胚的階段而變化，因此，時間效應(yīng)也可能是影響斑馬魚暴露于土臭素后線粒體呼吸的重要因素。 圖7 暴露于土臭素后斑馬魚胚胎的線粒體呼吸測定 土臭素誘導(dǎo)的代謝組學(xué)改變 代謝組中PCA和OPLS-DA顯示，4139.3 ng/L土臭素暴露組和SC組之間存在明顯差異（圖8A），表明土臭素接觸導(dǎo)致代謝改變。結(jié)果顯示，在斑馬魚幼蟲57種變化的代謝產(chǎn)物中，有3種代謝產(chǎn)物增加，而4139.3 ng/L 土臭素暴露組中54種代謝產(chǎn)物顯著減少（圖8B）。代謝物繪制成熱圖（圖8C）發(fā)現(xiàn)，三類脂質(zhì)即甘油磷脂（GP）、鞘脂（SL）和脂肪酰基（FA），在暴露于土臭素后受影響最大。有趣的是，所有磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰膽堿（PC）在暴露于土臭素后都顯著降低。GP和PC是產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的內(nèi)源性前體。此外，鞘脂代謝紊亂可能會誘發(fā)各種神經(jīng)退行性疾病。因此，暴露于土霉素引起的早期生活階段的行為改變也可能與斑馬魚幼蟲的脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。 此外，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)兩種膽汁酸，即甘氨熊脫氧膽酸（GUDCA）和甘氨脫氧膽酸（GDCA）在4139.3 ng/L 土臭素暴露后顯著降低，并且轉(zhuǎn)錄組中hnf4α的表達上調(diào)。總之，本研究的結(jié)果表明，脂質(zhì)是斑馬魚幼蟲暴露于土霉素后發(fā)生變化的主要代謝產(chǎn)物。 圖8 土臭素對斑馬魚代謝組的影響
研究結(jié)論 本研究通過生化參數(shù)檢測以及轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析表明，土臭素可能會導(dǎo)致水生動物的線粒體應(yīng)激，這為我們提供了對土臭素影響能量代謝潛在機制的新見解。也提醒我們，在未來的研究中應(yīng)注意慢性暴露后的發(fā)育毒性。
本研究的轉(zhuǎn)錄組測序和部分數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引： Zhou W, Wang Y, Wang J. et al. Geosmin disrupts energy metabolism and locomotor behavior of zebrafish in early life stages. Sci Total Environ. 2023 Feb 10;859:160222. doi: 10.1016/j.scitotenv.2022.160222.
