上海海洋大學(xué)在國(guó)際著名期刊《Aquaculture》發(fā)表新研究成果！本研究基于新型誘變法ARTP獲得2026個(gè)鈍吻魴突變體后代，并進(jìn)行快速生長(zhǎng)與耐低氧位點(diǎn)的篩選，為鈍吻魴未來的遺傳育種提供了新見解。
常壓室溫等離子體（ARTP）是一種新型的物理誘變技術(shù)，因其突變率高、使用方便、操作安全而被廣泛應(yīng)用于微生物育種。ARTP基因組誘變的原理是使用射頻大氣壓輝光放電（RF-APGD）。等離子體工作氣體流過兩個(gè)電極之間的放電區(qū)域，這是由外部施加的射頻（RF）電場(chǎng)引起的，因此，在等離子體炬噴嘴出口的下游形成非熱等離子體射流。等離子體中的各種誘變劑，如帶電粒子和自由基，可能會(huì)破壞DNA雙鏈，導(dǎo)致DNA損傷，并刺激保守和非保守區(qū)域產(chǎn)生修復(fù)機(jī)制，從而導(dǎo)致突變。
鈍吻魴（M.amblycephala）屬于食草動(dòng)物鯉科，具有較強(qiáng)的抗病性和缺氧敏感性。鈍吻魴是一種重要的淡水魚，在中國(guó)每年的總產(chǎn)量已超過76萬噸。在本研究中，我們對(duì)鈍吻魴進(jìn)行了ARTP突變，并確定了最佳誘變參數(shù)。進(jìn)一步篩選耐缺氧和快速生長(zhǎng)（H&F）的個(gè)體。使用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)H＆F組的遺傳變異進(jìn)行重測(cè)序分析。然后，探討了分子機(jī)制和優(yōu)質(zhì)品種的培育。
對(duì)四個(gè)組（包括兩個(gè)對(duì)照組（對(duì)照組1、對(duì)照組2）和兩個(gè)H&F組（H&F 1、H&F 2））進(jìn)行Illumina測(cè)序，獲得93.2 GB的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，樣品均為優(yōu)質(zhì)（Q30≥92.81%），平均深度為11.26×。
有參變異檢測(cè)、變異基因功能富集分析、qRT-PCR等。
ARTP誘變后，對(duì)存活和死亡的精子進(jìn)行染色，以顯示不同顏色的熒光（圖1A）。在相似的ARTP物理參數(shù)設(shè)置（120 W，15 SLM，2 mm）下，在0至3分鐘的處理時(shí)間內(nèi)，精子存活率隨處理時(shí)間的增加而顯著降低，而死亡率顯著增加（圖1B，C）。此外，在每個(gè)處理時(shí)間，40倍稀釋精子的胚胎異常率顯著高于10倍稀釋精子（圖2A，B）。40×稀釋精子處理1.5分鐘后的異常率為58.92±6.90%，接近50%（圖2A）。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，當(dāng)正常胚胎與異常胚胎的比例約為1:1時(shí)，基因突變效率最高，因此40×精稀釋精子處理1.5分鐘被認(rèn)為是最佳誘變條件，用于隨后的大規(guī)模誘導(dǎo)。
培養(yǎng)三個(gè)月后，2026個(gè)突變后代中正常和異常個(gè)體的比例約為1:1（圖2A）。ARTP治療組的體重范圍為15.68至52.13克，而對(duì)照組的體重在31.08至39.56克之間（圖2A，C，表2）。ARTP治療組的平均體重為30.71±15.82 g，顯著低于對(duì)照組的35.68±3.12 g。體重超過對(duì)照組的ARTP個(gè)體為8.19%，其中形態(tài)正常的個(gè)體占5.82%（圖2A，C）。與對(duì)照組相比，ARTP治療組中13.18%的形態(tài)正常個(gè)體的缺氧耐受性顯著改善（圖2B，D）。與對(duì)照組相比，H&F魚的平均體重增加了26.48%。
在1 mg/L、2 mg/L和6 mg/L的DO濃度下，對(duì)照魚的Na+/K+-ATP酶活性顯著低于H＆F魚（p<0.01）（圖3A）。H＆F魚的耐缺氧能力顯著提高（p<0.01）。在不同DO濃度下，H&F魚的平均紅細(xì)胞數(shù)（RBC）和血紅蛋白濃度（Hb）也顯著高于對(duì)照組（p<0.05）。
隨著DO濃度的降低，兩組的凋亡信號(hào)在鰓絲和弓中逐漸增強(qiáng)，同時(shí)，伴隨著層間細(xì)胞團(tuán)（ILCM）的減少（圖4A）。此外，與H＆F魚相比，對(duì)照組的鰓凋亡信號(hào)顯著增加（p<0.05），在不同DO下更多ILCM減少（圖4B）。
圖3 H&F與對(duì)照組耐缺氧相關(guān)指標(biāo)的比較
圖4 TUNEL法熒光檢測(cè)不同DO條件下H&F組和對(duì)照組鰓細(xì)胞凋亡
與參考基因組序列相比，對(duì)照組1和2中分別檢測(cè)到9,267和8,986個(gè)SNPs、2,672和3,144個(gè)InDels，而H&F 1和H&F 2中檢測(cè)到3,167,386和3,223,481個(gè)SNPs，927,125和928,735個(gè)InDel。在H＆F組中，72.98%的SNP位于基因間，4.69%和0%分別位于外顯子和內(nèi)含子。此外，64.75%的InDels位于基因間，0.60%和0%分別位于外顯子和內(nèi)含子，Indel類型約為34.65%。Veen圖顯示，對(duì)照魚和H&F魚共有5,082個(gè)SNP和1,328個(gè)InDel。平均突變率為2.98×10?3，是對(duì)照組的350倍。
圖5 H&F和對(duì)照組的SNP和Indel數(shù)
共有128,99H&F特異性SNPs位于2,059個(gè)基因的外顯子中，其中3,651個(gè)非同義突變位于1,223個(gè)基因中，富集到2,589個(gè)H&F特異GO term中。在每個(gè)類別中，根據(jù)p值選擇前10個(gè)GO富集條目。KEGG富集到332條途徑，其中有31個(gè)與缺氧和生長(zhǎng)相關(guān)。H＆F的特異性SNPs主要在HIF-1、VEGF、FoxO、JAK-STAT、MAPK、mTOR、PI3K-Akt和胰島素信號(hào)通路中，包括代謝、紅細(xì)胞生成、血管生成、免疫、合成ATP和生長(zhǎng)。在H&F魚中，8個(gè)缺氧（Epo X1、VEGFR1、HO-1a、LPA6）和生長(zhǎng)相關(guān)（FAS、6-PFK、生長(zhǎng)抑素1a、載脂蛋白Eb）基因在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)具有非同義突變，且存在表達(dá)差異（DE）。
圖6 H&F特異性SNP的GO富集分析與篩選出的突變基因
ARTP在魚類中的應(yīng)用很少。在目前的研究中，在基因組水平上，鈍吻魴的平均突變率達(dá)到2.98ｘ10-3，比對(duì)照組高約350倍。根據(jù)基因組測(cè)序分析，ARTP突變組中發(fā)現(xiàn)31,954,34個(gè)SNP和927,930個(gè)InDel，分別是對(duì)照組的350倍和320倍。一些ARTP突變的后代在生長(zhǎng)性能和耐缺氧性（H&F）方面表現(xiàn)出顯著的分化。本研究對(duì)今后鈍吻魴的育種具有重要意義，為研究鈍吻魴魚的耐缺氧性和生長(zhǎng)特性提供了重要參考。
本研究的重測(cè)序變異檢測(cè)測(cè)序與分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進(jìn)一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：021-64502808-8203）！
文章索引：Su X.L., Zhao S.S., Xu W.J., et al. (2022).Efficiently whole-genomic mutagenesis approach by ARTP in blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) .Aquaculture. doi.org/10.1016/j.aquaculture.2022.738241 .
