2023-01-09
影響因子：9.043
近日，上海交通大學附屬兒童醫院在微生物領域的《Microbiology Spectrum》發表新研究成果！本研究將從兒科患者中分離得到的共同產生NDM-1和IMP-4的變棲克雷伯菌進行基因組測序和功能分析，該菌株對碳青霉烯類和大部分其他β-內酰胺類藥物展示出耐藥性。該菌株具有高黏液性，但毒力減弱，基因組測序發現blaNDM-1與blaIMP-4共存在一個新的多藥耐藥混合質粒中，這是blaNDM-1和blaIMP-4 在高黏液性克雷伯菌的單質粒中共存的首次報道。
研究背景 肺炎克雷伯菌對碳青霉烯酶耐藥對全世界的人類健康構成嚴重威脅，主要由碳青霉烯酶的傳播驅動，碳青霉烯酶主要由肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)、新德里金屬-β-內酰胺酶(NDM)和亞胺培訥酶(IMP)組成。變棲克雷伯菌是肺炎克雷伯菌復合物的一個亞群，是一種共生細菌，能夠在植物、動物和人類中定殖。然而，由于最近被認為是血液和尿路感染的原因，它被認為是人類的一種新興病原體。與肺炎克雷伯菌相比，變棲克雷伯分離株通常表現出較低的抗生素耐藥性。盡管在世界范圍內有越來越多的報道，但對變棲克雷伯菌作為人類感染因子的研究仍舊很少。本研究首次報道了從中國兒科患者身上分離得到一株獨特的變棲克雷伯菌，該分離株具有典型的肺炎克雷伯菌特征超粘性，并含有多個碳青霉烯類耐藥基因，且這些耐藥基因位于一個新的雜交質粒上，研究表明該質粒可能是從克雷伯菌中引入并經歷了一系列的整合和重組進化事件。
研究材料與方法 1.實驗材料 變棲克雷伯菌 2.測序平臺 Illumina NovaSeq + PacBio 3.分析內容 細菌基因組完成圖測序、MLST分析、致病毒力因子分析、抗性基因分析和質粒遺傳背景圖分析等。
研究結果 1. 變棲克雷伯菌SHET-01分離與鑒定 2018年，在中國上海交通大學附屬醫院兒科重癥監護室的一名2歲女性患者的導尿管中發現了變棲克雷伯菌菌株SHET-01。通過細柱試驗發現該菌株表現出高黏度(HMV)，表明其極有可能為高毒。藥敏試驗顯示該菌株對碳青霉烯類抗生素美羅培南、亞胺培南和厄他培南表現出耐藥性，MIC分別為32、32和16 mg/mL 。與此一致的是，NG - Test CARBA 5側流實驗證實了NDM和IMP碳青霉烯酶的共同產生(圖1 )。考慮到高毒力和雙碳青霉烯酶共產的臨床意義，本研究對這一獨特菌株的遺傳特征和微生物學性狀進行實驗分析，為研究K. variicola提供了新的視角。 圖1：K. variicola SHET-01的微生物表型 2. 變棲克雷伯菌SHET-01的基因組測序和注釋 通過高通量測序發現該分離物具有一條5,508,387 bp的環狀染色體和兩個質粒pNDM-IMP-1 (347,317 bp)和pNDM-IMP-2 (144,371 bp)。MLST分型和Kaptive分型將該菌株鑒定為ST3936和KL30。將SHET - 01與變棲克雷伯菌 DX120E的染色體進行比對分析，發現其基因組含量高度相似，證實SHET - 01屬于變棲克雷伯菌 。 表1：K. variicola基因組特征 變棲克雷伯菌 SHET - 01的染色體上具有多個典型的肺炎克雷伯菌毒力因子，包括腸菌素( entABCDEFS )、氣桿菌素( iutA )、KFU鐵攝取系統( kfuABC )、纖毛type 1 ( fimABCDEFGHI )和纖毛type 3 ( mrkABCDFIJ )等。此外，該菌還存在生物被膜、尿素等致病因子。但未發現肺炎克雷伯菌HMV表型典型的rmp A/rmp A2或mag A基因，暗示變棲克雷伯菌中存在rmp A / rmp A2非依賴的HMV途徑。體外和體內毒力試驗表明，菌株SHET - 01能夠形成較強的生物被膜，但對人血清高度敏感，毒力水平顯著低于高毒力對照菌株NTUH - K2044，表明菌株SHET - 01為表型低毒力。 圖2：K. variicola基因組圈圖 此外，該菌株攜帶多種耐藥基因，如氨基糖苷類、氟喹諾酮類、碳青霉烯類和其他β-內酰胺類藥物。碳青霉烯酶編碼基因blaNDM - 1 ( 2個拷貝)和blaIMP-4共定位于質粒pNDM - IMP - 1上。該質粒是一個347.3 kb的不可分型質粒，含有除oqxAB和blaLEN17(圖3A)外的大部分耐藥基因。比對發現pNDM - IMP - 1與來自河北某醫院臨床分離的肺炎克雷伯菌blaIMP - 4質粒pKP1814 - 1 ( KX839207.1 )同源性為100 %，覆蓋率為83 % 。 3. 比較基因組學分析 對比分析發現，pNDM - IMP - 1和pKP1814 - 1具有相似的質粒骨架，都含有高度保守的質粒功能基因(如復制子基因repA和穩定性基因telB - stabD等)、接合轉移基因簇、插入元件、耐藥決定因子(如blaIMP-4和blaSFO)等功能基因，但都有一個約70 kbp的獨特遺傳構成。進一步對這一獨特的遺傳區域進行比對，發現其與p2315 - 2 - NDM ( CP039829.1 )和BHW35未命名質粒( CP020508.1 )具有同源性，但仍有多個片段未被鑒定(圖3A )，表明pNDM - IMP - 1的產生可能與遺傳重組事件和不同的DNA移動事件有關。 與之前報道的p KP1814 - 1質粒類似，bla IMP-4也是由位于IS5075側翼的新型復合轉座子Tn6404攜帶，包含位于mer操縱子( mer RTPFADE )下游的In804 - like整合子( Int1-bla IMP-4-itr A-qac G2-aad A4-cat B3 )，與Tn5563a - like轉座子( tin R-tnp A-mer R )和轉座子Tn1696 ( tnp R-tnp A ) ( 圖3B)殘基上游。研究發現，含blaIMP-4的In809整合子( Int1-blaIMP-4-qac G2-aac A4-cat B3 )在不動桿菌屬和腸桿菌科細菌中呈全球流行。In809 - like整合子與In809整合子相同，僅插入itr A。值得注意的是，如前所述，pNDM - IMP - 1和pKP1814 - 1共享該區域，表明含blaIMP-4 的In809 - like整合子在克雷伯氏菌屬中具有傳播潛力。 此外，發現blaNDM-1的2個拷貝均由插入序列ISCR1 元件的2個串聯拷貝攜帶，這與銅綠假單胞菌染色體的blaNDM-1 - ISCR1元件的2個串聯拷貝相似，只是pNDM - IMP - 1存在于aphA6缺失、ISAba125截短、trpF - dfrA27-aadA16插入的情況下。ISCR1元件下游為1個Int1整合子和6個耐藥盒( aadA4-blaOXA-1-catB3-aar-3-qacED1-sul1)，與大腸桿菌pEcNDM1的int1 - ISCR1結構相似，但pNDM - IMP - 1存在缺失dfrA27的情況(圖3C ) 。ISCR1元件是一類插入序列，是一種強大的基因捕獲工具，可以動員抗生素抗性基因，并為附近基因的表達提供啟動子。數據表明，ISCR1元件可能在blaNDM-1的動員和多重抗性區域的重組中發揮重要作用。 圖3 質粒基因組圈圖和質粒結構遺傳背景圖 結 論
這是首次在高黏液性克雷伯菌中共產IMP - 4和NDM - 1型碳青霉烯酶的報道，多重耐藥雜交質粒pNDM - IMP - 1可能來源于肺炎克雷伯菌，ISCR1元件可能有助于該質粒中blaNDM-1 和blaIMP-4 在克雷伯菌菌株中的匯聚。因此，必須警惕耐碳青霉烯類變棲克雷伯菌（尤其是對同時產多種碳青霉烯酶的臨床分離株）在兒童中的暴發和傳播，應優先對這些菌株進行長期監測。
本研究的細菌基因組測序與分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-56165883-832）！
文章索引：
Bingjie Wang, Fen Pan, Dingding Han, et al. Genetic Characteristics and Microbiological Profile of Hypermucoviscous Multidrug-Resistant Klebsiella variicola Coproducing IMP-4 and NDM-1 Carbapenemases [J]. Microbiology Spectrum, 2022 Feb 23;10(1):e0158121. doi: 10.1128/spectrum.01581-21.
