2022-12-26
《Journal of Fungi》
影響因子：5.724
近日，吉林大學(xué)在微生物領(lǐng)域的《Journal of Fungi》發(fā)表新研究成果！本研究將葡萄中分離得到的非釀酒酵母菌S.bacillus CC-PT4 (CGMCC No. 23573)進(jìn)行基因組測序和生物信息學(xué)分析，分析其有益特性、次生代謝產(chǎn)物、生物合成基因簇、殺傷毒素、溶葡萄球菌素、脅迫適應(yīng)性、絮凝性和粘附安全性，為后續(xù)該菌株的研究奠定基礎(chǔ)。
01、研究背景
非釀酒酵母常見于葡萄、釀酒及相關(guān)環(huán)境中。該物種于2002年首次在美國納帕谷受葡萄霉變影響的葡萄酒中分離，隨后在匈牙利的白葡萄酒中分離，鑒定其為新種并命名為Candida zemplinina。經(jīng)同工酶譜、26S rDNA酶切譜、26S rDNA測序分析，最終歸類為S. bacillaris 。S.bacillus具有良好的高滲透耐受性，可以耐受高濃度的糖和乙醇，該菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生甘油和低濃度乙醇以及多種風(fēng)味。此外，S.bacillus具有嗜果糖特性，Saccharomyces cerevisiae具有嗜糖特性，這使得它們能夠在發(fā)酵過程中長時(shí)間共存。許多研究發(fā)現(xiàn)，酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵有利于提高葡萄酒的香氣。
化學(xué)殺菌劑是抑制病原體的傳統(tǒng)方法，但反復(fù)使用這些化合物通常會導(dǎo)致各種不良反應(yīng)。然而，生物防治劑是減少化學(xué)殺菌劑使用的一種潛在替代品。釀酒酵母、布拉爾氏酵母和馬氏克魯維酵母都已被證明具有生物防治作用，桿菌也被證明具有生物防治的潛力。其抑菌機(jī)制可能包括營養(yǎng)物競爭、空間競爭、產(chǎn)生降解酶、殺傷毒素和揮發(fā)性有機(jī)物等。本文對S.bacillus CC-PT4進(jìn)行了全基因組測序并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)S.bacillus CC-PT4對MRSA(抗藥性金黃色葡萄球菌)具有抑制作用，對惡劣環(huán)境具有良好的適應(yīng)性。此外，S.bacillus CC-PT4攜帶與致病性和耐藥性相關(guān)的基因。總的來說，本研究對S.bacillus CC-PT4的全基因組測序和分析為了解該菌株的生物學(xué)特性和進(jìn)一步開發(fā)提供了有價(jià)值的信息。
02、 研究材料與方法
1.實(shí)驗(yàn)材料：S.bacillus CC-PT4
2.測序平臺：Illumina NovaSeq + PacBio
3.分析內(nèi)容：真菌近完成圖，次生代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測，絮凝與粘附分析等。
03、研究結(jié)果
1. S.bacillus CC-PT4基因組測序及組裝
S.bacillus CC-PT4全基因組大小為9.45 Mb, GC含量為39.50%。包含5個(gè)scaffolds，最長scaffold為4,159,713 bp，最短scaffold為8,503 bp, N50為4,154,241 bp。S.bacillus CC-PT4基因組圈圖如圖1所示。通過在基因組序列中完全對齊的單拷貝基因數(shù)量占單拷貝基因總數(shù)的百分比來評估基因組組裝的完整性，其中63.3%的基因與BUSCO單拷貝基因完全對齊。
圖1 S.bacillus CC-PT4基因組圈圖
2.功能原件分析
經(jīng)預(yù)測，S.bacillus CC-PT4有286個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列和1,020個(gè)分散在基因組中的穿插重復(fù)序列，S.bacillus CC-PT4有123個(gè)tRNAs, 4個(gè)rRNAs和7個(gè)其他非編碼RNAs。菌株CC-PT4基因組共預(yù)測到4,150個(gè)基因，占總基因組長度的63.70%，平均每個(gè)基因長度為1450.8 bp，共有4,266個(gè)外顯子，平均每個(gè)基因有1個(gè)外顯子，占總基因組長度的63.44%。
3. 基因注釋
在蛋白編碼基因中，P450數(shù)據(jù)庫共注釋了4,056個(gè)(97.73%)基因，其次是NCBI nr數(shù)據(jù)庫(3,538個(gè)，5.25%)、eggNOG數(shù)據(jù)庫(3,185個(gè)，76.45%)、KEGG數(shù)據(jù)庫(2,610個(gè)，62.89%)、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(3,363個(gè)，81.04%)、Go數(shù)據(jù)庫(2,888個(gè)，69.59%)，TCDB數(shù)據(jù)庫(670個(gè)，16.14%)。
本研究統(tǒng)計(jì)了S.bacillus CC-PT4在NCBI nr中注釋到的3,538個(gè)基因的物種信息，排名前25位的物種共涉及3,074個(gè)基因(圖2)，但標(biāo)注的基因中有10個(gè)序列一致性不低于97%的基因?qū)儆?em style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box; overflow-wrap: break-word !important;">Starmerella屬，9個(gè)基因?yàn)?em style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box; overflow-wrap: break-word !important;">S.bacillus，其中4個(gè)基因序列一致性為100%(表1)。
進(jìn)一步，用eggNOG對S.bacillus CC-PT4蛋白進(jìn)行功能注釋并進(jìn)行聚類分析。用eggNOG對S.bacillus CC-PT4標(biāo)記的3,185個(gè)基因的分類結(jié)果如圖所示。有499個(gè)基因沒有明確的功能，這可能與缺乏對桿菌的研究和缺乏內(nèi)參基因有關(guān)。功能分類明確的注釋基因最多的是翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生(321個(gè))；與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)的基因分別有146、108、145個(gè)。而細(xì)胞外結(jié)構(gòu)和核結(jié)構(gòu)所標(biāo)注的信息較少(4個(gè)基因)。有57個(gè)基因與次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝相關(guān)。此外，未發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)的基因，這與酵母是一種非運(yùn)動微生物的事實(shí)是一致的。
KEGG共標(biāo)記2,610個(gè)基因，分為8個(gè)大類和50個(gè)亞類。其中，與遺傳信息處理功能相關(guān)的基因數(shù)量最多，其次是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞過程。Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中S.bacillus CC-PT4基因組注釋到3,363個(gè)基因。在GO數(shù)據(jù)庫中，S.bacillus CC-PT4基因組有4,109個(gè)分子功能注釋基因，8,560個(gè)細(xì)胞成分注釋基因，10,108個(gè)生物過程注釋基因。
圖2 各數(shù)據(jù)庫注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果
表1 NCBI nr注釋的S.bacillus CC-PT4基因組序列統(tǒng)計(jì)(前10)
4. CAZy分析
CAZy數(shù)據(jù)庫主要包含與糖苷鍵的降解、修飾和生成相關(guān)的酶家族。酶家族被分為六類:糖苷水解酶(GHs)、多糖裂解酶(PLs)、碳水化合物酯酶(CEs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)、輔助活性(AAs)和碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)。經(jīng)預(yù)測，S.bacillus CC-PT4含有95個(gè)CAZy酶基因(表2)。
表2 CAZy分析統(tǒng)計(jì)
5.次生代謝產(chǎn)物合成基因簇
在antiSMASH預(yù)測的S.bacillus CC-PT4基因組中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，分別是非核糖體肽合成酶簇和萜烯類。對上述基因進(jìn)行MIBIG數(shù)據(jù)庫注釋，各基因BLAST得分最高的注釋結(jié)果見表3。
圖3 S.bacillus CC-PT4次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的預(yù)測結(jié)果
表3 基于MIBIG的S.bacillus CC-PT4次級代謝合成基因簇的注釋結(jié)果
6. Killer toxin 和 Lysostaphin基因
Killer toxin是酵母分泌的一種有毒蛋白質(zhì)，可以殺死其他酵母，但對自己不會造成傷害。Lysostaphin可特異性水解金黃色葡萄球菌肽聚糖的五甘氨酸交聯(lián)，從而裂解金黃色葡萄球菌，對耐藥金黃色葡萄球菌具有同樣的抑菌作用。根據(jù)S.bacillus CC-PT4基因組的注釋結(jié)果顯示有2個(gè)基因編碼Killer toxin，1個(gè)基因編碼Lysostaphin (表4)。
表4 S.bacillus CC-PT4基因組中的Killer toxin 和 Lysostaphin基因
7. 適應(yīng)力和耐藥分析
根據(jù)酵母基因組在eggNOG、Swiss-Prot和NCBI nr數(shù)據(jù)庫中的注釋，尋找參與脅迫適應(yīng)的相關(guān)基因。結(jié)果表明，S.bacillus CC-PT4基因組中存在許多有利于菌株適應(yīng)惡劣脅迫的基因，包括抗pH脅迫、抗膽汁脅迫、抗氧化應(yīng)激、抗離子和重金屬脅迫、抗熱應(yīng)激和其他脅迫。根據(jù)S.bacillus CC-PT4基因組的注釋結(jié)果，該菌株中有30個(gè)耐藥相關(guān)基因。
8. ,絮凝與粘附性分析
從SGD下載FLO1、FLO5、FLO8、FLO9、FLO10、FLO11、FIG2和AGA1編碼絮凝蛋白序列，并對S.bacillus CC-PT4基因組進(jìn)行BLAST處理。結(jié)果表明，S.bacillus CC-PT4基因組中有5個(gè)基因(scaffold1.378, scaffold1.1051, scaffold1.1055, scaffold2.1852, scaffold2.1859)編碼絮凝蛋白。從圖4可以看出，基因scaffold1.378與FLO1、FLO5、FLO10三個(gè)絮凝蛋白具有序列一致性，基因scaffold2.1852與FLO1、FLO5、與FLO9中的具有序列一致性，基因scaffold2.1859與FLO9、FLO10具有序列一致性。此外，這些基因與絮凝蛋白的多個(gè)序列片段具有同源性。
此外，從SGD中下載了41個(gè)與粘附相關(guān)的蛋白序列，并利用BLAST對S.bacillus CC-PT4基因組和這些蛋白進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，S.bacillus CC-PT4基因組中65個(gè)基因與粘附蛋白BGL2、CKA2、CRH1、CRR1、CWH41、DCW1、DFG5、FKS3、GSC2、KRE6、KTR1、LAS21、PST1、ROT2、SCW10、SCW11、SCW4、SKN1、SMK1、SPI1、SUN4、UTR2、YPS1、YPS3的一個(gè)或多個(gè)蛋白序列一致。
圖4 利用絮凝蛋白序列對S.bacillus CC-PT4基因組進(jìn)行BLAST分析
9. 致病性分析
根據(jù)S.bacillus CC-PT4全基因組預(yù)測的PHI表型突變型基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)如圖5所示。PHI數(shù)據(jù)庫共注釋到1013個(gè)基因，其中最多的是毒力降低，有545個(gè)基因，而拮抗增強(qiáng)的基因?yàn)榱恪Ｍㄟ^進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)與人類疾病相關(guān)的基因有34個(gè)(表5)。
圖5 S.bacillus CC-PT4中病原菌-宿主相互作用(PHI)基因的分布
表5 S.bacillus CC-PT4毒力分析
04、結(jié) 論
本研究對S.bacillus CC-PT4的全基因組序列進(jìn)行了組裝和生物信息學(xué)分析。S.bacillus CC-PT4全基因組大小為9.45 Mb, GC含量為39.50%。此外，利用多個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測和注釋了4150個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。蛋白質(zhì)編碼基因的注釋結(jié)果顯示，許多基因與應(yīng)激適應(yīng)、次生代謝產(chǎn)物、抗菌功能、安全性等相關(guān)，包括2個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，2個(gè)基因編碼Killer toxin，1個(gè)基因編碼Lysostaphin。綜上所述，獲得S.bacillus CC-PT4的全基因組序列有助于更好地了解該菌株的特性，有利于該菌株的挖掘和應(yīng)用。
本研究的真菌基因組測序與分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進(jìn)一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：025-56165883-832）！
文章索引：
Yong Shen, Xue Bai, Xiran Zhou, et al. Whole-Genome Analysis of Starmerella bacillaris CC-PT4
against MRSA, a Non-Saccharomyces Yeast Isolated from Grape [J]. Journal of Fungi, 2022, 8:1255.
doi:10.3390/jof8121255
