2022-12-19
《Infection, Genetics and Evolution》
影響因子：4.393
近日，汕頭大學在醫學領域的《Infection, Genetics and Evolution》發表新研究成果！本研究通過組裝注釋獲得了伊蚊族刺擾伊蚊和里海伊蚊兩個物種的完整線粒體基因組，并進行系統發育分析。結果表明刺擾伊蚊和伊蚊屬物種聚集在一個姐妹類群，里海伊蚊和騷擾亞蚊屬物種聚集在一個姐妹類群，且所有類群都成單系。研究結果為進一步研究伊蚊族的分類學、群體遺傳學和系統學提供了重要的分子標記資源。
研究背景
蚊科（Culicidae）是最成功的昆蟲類群之一，大多數物種可分為按蚊亞科（Anophelinae）和蚊亞科（Culicinae）兩個亞科。蚊亞科是一個多系亞科，共有3048種，分為38個屬和11個族，被認為是最大的亞科。大多數種類的蚊子對爬行動物和哺乳動物（包括人類）表現出嗜血行為，因此，它們可以作為幾種病原體的媒介。已知伊蚊屬（Aedes）和騷擾蚊亞屬（Ochlerotatus）傳播登革熱、基孔肯雅病毒和黃熱病病毒。一些新出現的病原體，如寨卡病毒，起源于森林環境。它們在野生動物和節肢動物媒介物種（包括蚊子）之間循環；然而，對這些病原體的循環知之甚少。由于某些生命階段物種之間的形態同質性以及缺乏必要的分類學專業知識，很難快速準確地鑒定載體物種。系統發育分析可用于識別入侵伊蚊族（Aedini）族的姐妹物種，了解入侵Aedini族物種的相互親緣關系及其進化的時間非常重要，可以了解它們在病原體傳播周期中的作用。
盡管Aedini族具有醫學意義，但目前公開的基因組數據有限。考慮到線粒體（MT）基因組標記在蚊子分子分類學研究中的巨大潛力，在本研究中，首次使用下一代測序（NGS）技術對刺擾伊蚊（A. vexans）和里海伊蚊（O. caspius）的線粒體基因組進行測序，并對A. vexans和O. caspius的完整MT基因組進行測序和分析，通過MT基因組中13個蛋白質編碼基因的氨基酸序列評估這兩個物種的系統發育學位置。
研究材料與方法
1.實驗材料：蚊子樣本收集于中國黑龍江省
2.測序平臺：Illumina NovaSeq
3.分析內容：線粒體基因組測序、比較基因組學分析、密碼子偏好性分析、選擇壓力分析、核苷酸多樣性分析、系統發育分析
研究結果
1. 刺擾伊蚊和里海伊蚊線粒體基因組特征
A. vexans和O. caspius的完整線粒體（MT）基因組長度分別為15,861 bp和15,954 bp（圖1），為環狀雙鏈DNA分子。兩個MT基因組都包含37個功能和保守的亞基：13個PCG（包括cox1-3、nad1-6、nad4L、atp6、atp8和cytb）、22個tRNA和2個rRNA（rrnL和rrnS）。這兩個物種MT基因組的平均AT含量為78.54%（A. vexans）和79.36%（O. caspius），這與先前報道的蚊子MT基因組的特征相似。
圖1：A. vexans和O. caspius線粒體基因組結構圖。
A. vexans（15,861 bp）的MT基因組長度與A. notoscriptus（15,846 bp）相似，但略短于A. alboanullatus（16,181 bp）。在Ochlerotus屬中，O. caspius的線粒體基因組長度（15,954 bp）與O. nigritrax（15,943 bp）相似，略長于O. vigiax（15,877 bp）。這兩種蚊子的整個MT基因組的核苷酸組成偏向于A和T， A+T含量、AT偏移和GC偏移基本一致。此外，控制區的長度為A. vexans（948 bp）和O. caspius（1026 bp），這兩個區域的長度與A. alboanullatus（1072 bp）、A. notoscriptus（939 bp）和O. nigritrax（1066 bp）不同。
2. 蛋白編碼基因特征
O. caspius和A. vexans兩個MT基因組都有13個PCG，PCG區長度分別為11,215 bp和11,217 bp，AT含量分別為78.57%和77.51%。所有13個PCG（除了帶有TCG的cox1和帶有GTG的nad5）使用ATN作為起始密碼子，ATG是最常用的，其次是ATT，所有PCG使用TAA作為標準終止密碼子。ATN、TTG、GTT和GTG被用作無脊椎動物MT基因組的典型起始密碼子，大多數蚊子PCG使用ATN作為起始密碼子。對MT基因組組成不對稱性的分析表明，AT偏移值為正值（A. vexans 0.02，O. caspius 0.01），而GC偏移值為負值（A. vexens - 0.17，O. caspius - 0.16）。A. vexans MT基因組內的AT偏移值范圍為-0.04（atp8和rrnS）至-0.26（nad1）；GC偏移值范圍為-0.04（cox1）至0.36（nad4L）。O. caspius MT基因組內的AT偏移值范圍為-0.05（rrnS）至-0.26（nad1）；GC偏移值范圍為-0.2（nad3）至0.38（nad4L）（圖2）。昆蟲MT基因組表現出明顯的基于鏈的核苷酸組成偏差，這是由于復制或轉錄相關的突變。
圖2：線粒體基因組的AT/GC含量和AT/GC偏移。
A. vexans MT基因組中的PCG包含3499個氨基酸，包括145個強堿性氨基酸（K、R），155個強酸性氨基酸（D，E）、1614個疏水性氨基酸（A，I，L，F，W，V）和949個極性氨基酸（N，C，Q，S，T，Y）。類似地，在O. caspius中有3488個氨基酸，強堿性、強酸性、疏水性和極性氨基酸的數量分別為146、156、1610和943。密碼子使用偏差（CUB）分析表明幾乎所有的密碼子都用于兩個MT基因組。然而，GCG（Ala）僅在A. vexans MT基因組中使用，而CGC（Arg）僅用于O. caspius MT基因組。UUA（Leu1）是A. vexans MT基因組中最常見的密碼子，其CUB值為11.93，O. caspius MT基因組中，最常見的密碼子是UUU（Phe）。CGG（Arg）是A. vexans MT基因組中最不頻繁的密碼子，CUB值為0.05，GCC（Ala）是O. caspius MT基因組中頻率最低的密碼子（CUB值0.03）（圖3）。RSCU偏好與CUB相似（圖4）。以A或U結尾的密碼子比以CG或GC結尾的密碼更頻繁使用，這是一些雙翅目昆蟲的共同特征。
圖3：線粒體基因組的密碼子使用偏差（CUB）。
圖4：線粒體基因組的相對同義密碼子使用度（RSCU）。
3. 核糖體RNA基因分析
兩個RNA基因（rRNA，rrnL和rrnS）在兩個MT基因組中的位置相同，有趣的是，AT含量非常相似，盡管幾乎所有物種都來自不同的屬；AT偏差為負，GC偏差為正（圖2）。此外，這兩個rRNA的長度保守，與以往蚊子MT基因組研究所得的數值一致。
在A. vexans和O. caspius MT基因組中，22個tRNA的總長度分別為1494 bp和1489 bp，單個基因長度從69 bp到72 bp不等 。通過對22個tRNA的結構預測，21個tRNA具有經典三葉草葉狀結構。剩下的一個tRNA，即Ser1，顯示了DHU臂缺失的顯著特征，它被一個環取代，類似的特征已在早期對伊蚊科和其他昆蟲的研究中報道。
4. 進化分析
為了驗證作用于蛋白質編碼MT基因組不同區域的進化壓力，進行了非同義和同義替換率（dN/dS）分析。結果表明，在負選擇作用下，不同區域整體發生了進化，dN/dS值<1，比率從cytb值（0.024–0.044）到nad6值（0.109–0.895）不等。根據獲得的平均值，進化壓力的影響順序如下：cytb<cox1<cox3<atp6<cox2<nad3<nad1<nad4l<nad4<nad5<nad2<atp8<nad6（圖5）。
圖5：非同義（dN）與同義（dS）核苷酸替換率的比率。
此外，研究還評估了線粒體序列與Aedini族其他成員的線粒體序列之間的核苷酸多樣性（π值）。結果顯示Aedes的π值在0.04和0.7之間，Ochlerotus的π值在0.16和0.66之間。所分析的MT基因組的蛋白質編碼區nad5、nad4、nad4L、nad6和nad1在評估的三組序列中顯示出較高的核苷酸多樣性比率（圖6）。
圖6 線粒體基因組的核苷酸多樣性（π）
5. 系統發育分析
使用來自30個分類群的13個PCG基于兩種分析方法（BI和ML）進行系統發育分析（圖7）。蚊科包括29個分類群形成一個單系大類群，以Dixella aestivalis為外類群。庫蚊科呈現了一個拓撲結構，有兩個支撐良好的分支，對應于按蚊亞科和蚊亞科。按蚊亞科包含6個物種，分為三個亞類。Culicinae亞科的支序包含23個分類群，分為三個子類，分別代表Aedini、Culicini和Sabethini族。系統發育分析結果將A. vexans其歸入Aedini族，根據當前的分類分類，該族呈現了一個支持良好的Aedes屬分支。而O. caspius聚集在以O. nigritrax + O. vittiger的拓撲結構所代表的Ochlerotus屬，Haemagogus作為姐妹群被恢復。
圖7 13個PCG氨基酸系統發育分析。
結 論
本研究通過對線粒體基因組測序、組裝和注釋，首次報道了伊蚊族刺擾伊蚊和里海伊蚊兩個物種完整線粒體基因組。并通過對線粒體基因組中13個蛋白質編碼基因的氨基酸序列進行了系統發育分析，確定了兩個物種的系統發育學位置。隨著伊蚊科物種線粒體基因組公共數據庫的完善，將能夠進行更全面的系統發育重建分析，闡明其系統發育關系。
本研究的denovo測序和部分分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-56165883-832）！
文章索引：Ma, X. X., Wang, F. F., Wu, T. T., et al. First description of the mitogenome and phylogeny: Aedes vexansand Ochlerotatus caspius of the Tribe Aedini (Diptera: Culicidae). Infection, Genetics and Evolution (2022). https://doi.org/10.1016/j.meegid.2022.105311.
