2022-12-12
《International Microbiology》
影響因子：3.097
近日，四川農業大學獸醫學院在微生物領域的《International Microbiology》發表新研究成果！本研究將牛乳腺炎相關的牛奶樣品中分離得到的噬菌體BM31進行基因組測序和功能分析，發現該噬菌體為溫和噬菌體，具有爆發規模小、潛伏期短和宿主范圍窄等基本生物學特征，該噬菌體與葡萄球菌噬菌體家族虹膜病毒科B14亞簇的特征一致。該噬菌體的分離與鑒定有助于建立葡萄球菌噬菌體數據庫，為潛在的應用提供了理論依據。
研究背景
球菌可直接或間接導致雞的關節炎和雞冠壞死、奶牛的乳腺炎、馬的眼外感染、綿羊的綿羊葡萄球菌性皮炎和豬的滲出性表皮炎等疾病。噬菌體是地球上數量最多的生物實體，全世界估計總數超過1031，超過細菌宿主10:1，它們在幾乎所有的微生物生態系統中都發揮著顯著的作用。在動物模型和人類臨床試驗中，噬菌體在多藥耐藥感染的治療中顯示出顯著的治療效果，其中包括已被證明無效的抗生素。同時噬菌體也被用作診斷工具，用于食品生產和生物技術，噬菌體及其衍生蛋白可被工程化以檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、空腸彎曲桿菌和志賀氏菌。觀察噬菌體與細菌的相互作用可以提高對細菌致病機制的理解，為噬菌體治療或噬菌體檢測提供基礎證據。本研究旨在鑒定一種溫和噬菌體vB_SarS_BM31的特性，該噬菌體首次被報道用于阿爾萊葡萄球菌治療。
研究材料與方法
實驗材料
噬菌體BM31
測序平臺
Illumina NovaSeq
分析內容
噬菌體基因組測序、ANI分析、系統發育樹構建、一步生長曲線、宿主范圍鑒定等。
研究結果
1.噬菌體BM31形態
分離的噬菌體在其指示宿主上孵育過夜后，形成直徑為1.98±0.02mm的大而透明的斑塊，并帶有混濁的光環（圖1a）。此類光環可能表明存在噬菌體編碼的解聚酶，該解聚酶可以消除細菌細胞壁中的胞外多糖。透射電子顯微鏡（TEM）觀察發現該噬菌體含有平均直徑為63±7 nm的等長頭部和平均尾部長度和寬度分別為168±7 nm和14±7的長而不收縮的尾部，故將BM31分類為具有B1形態類型的Siphoviridae噬菌體；同時該噬菌體在尾部末端觀察到基板（圖1b）。
圖1 噬菌體BM31
2.噬菌體BM31的基本特征
噬菌體BM31在氯仿或乙醚中噬菌體不能存活，而對照組（SM緩沖液）中的噬菌體滴度保持在約2×108 PFU/mL（圖2a）。這一結果表明，噬菌體BM31對氯仿和乙醚都敏感，這意味著衣殼或噬菌體周圍的脂質層中存在脂質。因此，在BM31的進一步研究中不使用氯仿或乙醚。
在pH穩定性測定中，BM31在pH =7時顯示出最高的滴度，平均為2×107 PFU/mL，在pH =9下孵育1小時，平均滴度為1.4×107 PFU/ mL（70%存活率）；在其他pH組中沒有噬菌體顆粒存活（圖2b）。這一發現表明BM31可以耐受弱堿性環境，但最佳生存環境可能是中性的。
熱穩定性測定表明，BM31的耐受溫度為40-60°C（圖2c），該噬菌體表現出良好的熱穩定性。結果表明，在40℃孵育60分鐘后，噬菌體滴度為1.07×1012（14.50%存活率），而初始滴度為7.40×1012。在50℃和60℃孵育60min后，噬菌體滴度分別為1.70×1011（2.29%存活率）和2.32×1010（0.31%存活率）。BM31在70°C的溫度下不能存活超過20分鐘，在80°C時，存活時間少于20分鐘。
MOI測定的結果表明，當MOI值達到0.001時，BM31表現出最佳的宿主裂解和自我復制能力。最佳MOI值與相對較低的成本相關，產生的噬菌體滴度顯著高于其他組（圖2d）。具體而言，BM31的生存能力是穩定的，這與其結構有關，因為據報道，Siphoviridae家族是最穩定的噬菌體。
圖2 噬菌體BM31的基本特征
3.一步生長曲線及宿主范圍實驗
對于噬菌體BM31，潛伏期為20分鐘，每個感染細胞有49個噬菌體顆粒。與其他噬菌體相比，BM31具有更短的潛伏期和更小的爆發大小。爆發大小與噬菌體組分的合成和組裝速率、潛伏期、代謝活性、生存環境和宿主細菌的蛋白質合成機制相關，而與噬菌體的細胞大小或DNA組成無關。
圖3 一步生長曲線
在所有13個測試宿主范圍的葡萄球菌菌株中（表1），BM31只能裂解S.arlettae的宿主菌株，這表明它對宿主范圍極窄的宿主具有特異性。
表 1用于宿主范圍試驗的葡萄球菌列表
4.基因組學概述
用DNA酶I處理BM31中的核酸導致了其基因組的消化，而用RNA酶A和綠豆核酸酶處理顯示出不敏感性，從而表明BM31是一種dsDNA病毒（圖4）。噬菌體BM31的完整dsDNA基因組大小為42,271bp，GC含量為 34.59%。BLASTp比對發現65個ORF中有53個ORF可以比對上功能。在53個蛋白質中，只有26個可能的功能，剩余的12種蛋白質無法匹配到NCBI數據庫中的任何蛋白質，并被注釋為假設蛋白。表2列出了通過HHpred分析鑒定的與BM31具有遠同源性的ORF。盡管這些假設的蛋白質分布在BM31基因組中，但明顯的模塊化組織由參與病毒形態發生（藍色）、DNA包裝和復制（綠色）和裂解（紫色）的基因組成（圖5）。除了位于基因周期中間的整合酶（ORF28）和轉錄調節器（ORF32）外，大多數已知的功能基因都在正鏈上。未檢測到tRNA基因、抗生素抗性基因和原噬菌體。然而，觀察到一種名為pemK和mazF-like毒素（ORF30，pfam02452）的毒力因子，它是II型毒素抗毒素系統的內核糖核酸酶毒素。
圖4 BM31的核酸鑒定
圖5 BM31基因組圈圖
表2與BM31具有遠同源性的ORF
5.基因組模塊
根據注釋基因的功能，BM31的整個基因組被分為四個模塊：結構，裂解、溶血素及DNA包裝和復制基因。
結構模塊：
參與衣殼組裝和包裝的蛋白質包括末端酶小亞基（TerS）（ORF1）、末端酶大亞基（TerL）（ORF2）、門蛋白（ORF4）、原頭蛋白酶（ORF5）和衣殼蛋白（ORF6）。噬菌體末端酶的大小亞基是參與DNA易位和頭部填充的關鍵酶。在一些細菌中觀察到前蛋白酶，可能是水平轉移的結果。入口蛋白是包裝馬達的一個關鍵元件，它在大亞基終止酶（ATP酶活性）的幫助下將噬菌體基因組泵入衣殼。七種蛋白被鑒定為參與尾部形態發生和噬菌體組裝的結構蛋白：頭尾銜接蛋白（ORF9）、頭尾連接蛋白（ORF10）、主要尾部蛋白（ORF12）、尾部長度帶測量蛋白（ORF15）、尾部纖維蛋白（ORF16、ORF17）和次要結構蛋白（ORF29）。ORF15是BM31全基因組中最長的序列，被注釋為尾部長度帶測量蛋白（TMP），一種尾部相關蛋白。TMP不僅存在于尾部噬菌體中，也存在于無尾噬菌體中，從而決定了感染期間尾部長度和DNA向宿主細胞的轉移。對于大多數噬菌體來說，尾部纖維是第一個識別細菌膜上受體并引發感染的蛋白質。衣殼組裝基因在尾部組裝基因上游的位置和最長TMP的存在表明，該結構模塊對應于典型的Siphoviridae形態發生模塊。
裂解模塊：
裂解盒由膽堿（ORF25）和溶血素（ORF26）組成。溶血素（ORF26）成分由N-末端CHAP內肽酶結構域（pfam 05257，氨基酸27–115）和一個N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶結構域（MurNAc LAA，cd02696，氨基酸173-355），其與噬菌體Ph28中溶血素的結構域成分相同。此外，BM31的溶血素組分在C端含有SH3肽聚糖結合結構域（氨基酸377–438），這證實了模塊化在葡萄球菌溶血素中普遍存在。膽堿（ORF25）成分屬于SPP1家族（PF04688），與南非未培養的Caudovirales噬菌體的相似性為90.59%。連續使用溶血素和膽堿可導致大多數尾部噬菌體裂解并控制感染周期的長度。
溶血模塊：
溶源盒含有整合酶（ORF28），但缺乏CI型阻遏物，通常存在于其他葡萄球菌噬菌體中。然而，λ阻遏物樣的Cro/C1型螺旋轉螺旋（HTH）結構域（ORF33）是一種DNA結合結構域和轉錄調節器，被預測位于XRE家族轉錄調節器（ORF32）的下游。HTH結構域可能表明存在一種阻遏物，該阻遏物不能在BM31完整基因組中的未知功能蛋白或假設蛋白之外進行注釋。BM31的噬菌體整合酶結構域（PF00589.24）屬于pfam00589，表明整合酶是酪氨酸重組酶（Y-Int），其具有酪氨酸作為催化殘基。初步證據表明，BM31具有兩個裂解系統，并傾向于遵循裂解循環。例外情況可能是涉及細胞應激的情況，其中噬菌體中的抗阻遏蛋白干擾阻遏蛋白的功能，并迫使噬菌體在一個稱為裂解溶源開關的過程中采用裂解循環。噬菌體的整合重組對于葡萄球菌噬菌體phi11，rinA和rinB是int基因的活性表達所必需的，轉錄激活劑RinB（ORF62）與int基因是負責整合重組的唯一病毒基因。
DNA包裝和復制模塊：
DNA包裝和復制模塊由單鏈DNA結合蛋白（ORF42）、復制起始蛋白（ORF4）、解旋酶DnaB（ORF46、ORF48）等組成。所有已知的溫和葡萄球菌噬菌體都屬于Siphoviridae家族，這表明噬菌體BM31可能被歸類為溶源性噬菌體；具體而言，當整合酶（ORF28）、致病性島蛋白（ORF34）和dUTPase（ORF60）在BM31中注釋時，致病性島可能是一種與噬菌體相關的染色體島，如金黃色葡萄球菌致病性島（SaPIs），它們是與溫帶噬菌體密切相關的高流動性和超抗原基因元件。SaPI攜帶編碼毒性休克綜合征毒素、葡萄球菌腸毒素B和其他重要毒力因子的基因。SaPI穩定地存在于原噬菌體中，只能通過劫持輔助噬菌體的衣殼而非自身來實現轉導。SaPI內的stl基因是一個主阻遏物，可以被輔助噬菌體表達的dUTPase抑制，從而激活SaPI裂解循環。TerS識別并切割SaPI pac位點后，將SaPI DNA填充到這些噬菌體衣殼中，導致釋放成熟的子代噬菌體（數量減少），細菌裂解后釋放SaPI顆粒（衣殼比子代噬菌體小）。
HNH歸巢核酸內切酶（ORF40、ORF47、ORF65）基因是噬菌體基因組中常見的高度專門化的自私遺傳成分。HNH核酸內切酶可以促進其自身和相關基因的移動性，甚至通過切割其他競爭噬菌體的DNA來排除它們。它還可能干擾其插入位置周圍基因的表達，并破壞活性ORF。
6. 生命周期
本研究中使用的所有噬菌體蛋白（衣殼蛋白、門蛋白和卷尺蛋白）都是在隨機選擇的阿爾萊特葡萄球菌菌落中檢測到的，無論該菌株是否被BM31入侵（圖6）。結果表明，BM31具有溶原性的生命周期。所有隨機選擇的菌落在被噬菌體BM31裂解之前和之后都有幾個編碼噬菌體結構蛋白的噬菌體基因。在宿主菌株基因中檢測到的噬菌體基因可能是它們將自身基因組整合到宿主染色體中并通過細菌復制實現自我復制能力的結果，這表明所檢測的噬菌體是溫和噬菌體。在從未用BM31處理過的菌落中也觀察到噬菌體基因，這可能是因為阿爾萊特葡萄球菌和BM31都是從一個牛奶樣本中分離出來的。當第一次分離宿主菌株時，噬菌體很可能已經經歷了溶原循環并整合到宿主菌株染色體中。基因組注釋和PHACTS在線軟件分析的結果表明，BM31可能是一種具有pac位點的溫和噬菌體。
圖6阿爾萊特葡萄球菌中噬菌體BM31的特定結構電泳圖
7. 分類分析
BM31顯示出與噬菌體phiRS7（KF589919）最接近的序列同一性，查詢覆蓋率為36%，核苷酸同一性為83.82%。為了研究噬菌體BM31與GenBank中存儲的其他相關噬菌體之間的關系，基于噬菌體衣殼蛋白（ORF6）的氨基酸序列和完整基因組序列構建了兩個系統發育樹。這兩棵樹都揭示了BM31和葡萄球菌噬菌體phiRS7之間的密切關系，phiRS7屬于虹膜病毒科（圖7）。該結果與PHASTER在線分析軟件的結果一致。結合TEM測定的形態學特征，噬菌體BM31被定義為虹膜病毒科的一員。
所有205個葡萄球菌噬菌體可分為四個簇（A、B、C和D）。根據這一標準，本文旨在將噬菌體BM31分類為其中之一。對BM31的三個保守pfam進行注釋：pfam1520（ORF26）與亞群C3相同；pfam692（ORF60）和pfam1844（ORF65）與亞群D1相同，也表現出溫和的行為和長尾形態，這是群B特有的。因此，通過ANI分析將亞群B的132個噬菌體、亞群C3的5個噬菌體和亞群D1的2個噬菌體與BM31進行了比較。結果表明，BM31與phiRS7（KF589919）的ANI最高，為79.83%；因此，我們將BM31分類為與B14中的phiRS7相同的亞簇，這是B下的亞簇（圖8）。
圖7 BM31和其他相關噬菌體的系統發育樹
圖8 ANI熱圖
為了對BM31和其他噬菌體之間的基因組結構差異進行更細致的理解，將BM31與最同源的phiRS7噬菌體的基因組進行了比較分析（圖9）。結果表明，這兩種噬菌體的基因組之間具有高度的相似性和保守性，特別是在結構基因方面。部分基因的插入和缺失變異主要反映在整合酶、解旋酶和HNH核酸內切酶中。這些結果還證明了在BM31基因組中可能存在RinB基因，該基因最初被注釋為假設蛋白（ORF62）。
圖9 BM31和phiRS7的基因組比較
雖然我們的目標是將BM31用作治療/檢測應用，但一個問題是噬菌體本身的毒性。溶原循環、pemK和mazF-like毒素的存在可能決定了噬菌體BM31作為抗生素的罕見可能性。在這些情況下，源自BM31的內溶素蛋白是否可以作為安全的單一制劑或與抗生素配合使用，還需要進一步研究。研究表明，噬菌體顆粒、源自噬菌體的內溶素和源自內溶素的細胞壁結合域都是有效的檢測劑。BM31的極窄宿主范圍表明噬菌體作為抗體的高度特異性。為了實現同時檢測多個細菌，噬菌體需要廣泛的宿主譜。內溶素蛋白的表達是否會拓寬宿主范圍，還需要在后續實驗中進行驗證。
結 論
BM31是一種新型且罕見的噬菌體，對阿爾萊特葡萄球菌具有高度特異性。目前的發現補充了CoNS的噬菌體數據庫，闡明了細菌與噬菌體相互作用的潛在機制，這可能會轉化為臨床應用。BM31在正常和穩定環境中均存活，并表現出較小的爆發規模和較短的潛伏期。小的爆發規模可能與其溶原性生命周期有關，而較短的潛伏期可能表明應用噬菌體時具有速效性和高效性。雖然阿爾萊特葡萄球菌不是一種主要的致病細菌，但在本研究中，它是從乳腺炎牛奶樣本中分離出來的，可能會污染乳制品。由于溶原性復制，BM31不能用作治療劑；然而，在進一步的研究中，噬菌體衍生的蛋白質（如溶血素）可用于檢測和控制阿爾萊特葡萄球菌。
本研究的噬菌體基因組測序與分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-56165883-832）！
文章索引：
Guangli Han, Jieru Zhang, Zidan Luo, et al. Characteristics of a novel temperate bacteriophage against Staphylococcus arlettae (vB_SarS_BM31) [J]. International Microbiology, 2022, 11(7):1-15.
doi: 10.1007/s10123-022-00292-3
