2022-11-15
《The Plant Cell》 影響因子：12.085
文章題目：Loss-of-function of SAWTOOTH 1 affects leaf dorsiventrality genes to promote leafy heads in lettuce 技術(shù)手段：BSR-seq，RT-qPCR，RNA-seq，CHIP-seq等； 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)于近期在《The Plant Cell》上發(fā)表了SAWTOOTH 1基因的功能缺失影響葉背腹性基因以促進生菜結(jié)球發(fā)育的研究成果。
生菜(Lactuca sativa L.)是世界上主要的蔬菜作物。在生菜、卷心菜和芥菜等蔬菜作物中，結(jié)球的形成是一個重要的園藝性狀。結(jié)球性便于收獲和運輸，延長保質(zhì)期，并改善這些葉類蔬菜的質(zhì)地。結(jié)球蔬菜葉片的背腹發(fā)育不平衡，包括葉片近軸與遠(yuǎn)軸的細(xì)胞分裂不協(xié)調(diào)。盡管結(jié)球是一種重要的園藝性狀，但對其潛在的遺傳和分子機制仍然知之甚少。
一 技術(shù)路線
二、研究結(jié)果
生菜結(jié)球基因LHL1基因分離群體的構(gòu)建和克隆 本研究利用結(jié)球和不結(jié)球生菜為親本構(gòu)建了一個結(jié)球分離群體F5，且在該群體中，結(jié)球是隱性性狀，結(jié)球個體近軸部分的細(xì)胞排列紊亂。通過BSR-seq分析，證實F5群體中的結(jié)球表型是由LHL1位點獨立控制的結(jié)果。利用F5分離群體對LHL1基因進行精細(xì)定位和克隆，發(fā)現(xiàn)LHL1位點中LG4_402589基因編碼了一種與擬南芥SAW1同源的蛋白，命名為LsSAW1。該基因外顯子上存在一個堿基的缺失，導(dǎo)致了ORF中有一個終止密碼子，因此其功能缺失等位基因Lssaw1是控制生菜結(jié)球的LHL1基因的一個很好的候選基因。 圖1 F5分離群體不結(jié)球和結(jié)球個體的表型及LHL1基因的遺傳定位 轉(zhuǎn)化證實了LsSAW1對結(jié)球的功能 研究者在結(jié)球生菜中超量表達(dá)LsSAW1和在不結(jié)球生菜中敲除LsSAW1，結(jié)果表明，敲除LsSAW1會導(dǎo)致生菜結(jié)球，其功能缺失突變對于生菜葉球的發(fā)育至關(guān)重要。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，LsSAW1是一種核定位蛋白，與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能一致。逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR結(jié)果顯示，LsSAW1主要在葉、花和頂端組織中表達(dá)，而很少在莖、根和種子組織中表達(dá)。原位雜交研究表明，LsSAW1在莖尖分生組織和葉原基的近軸與遠(yuǎn)軸均弱表達(dá)，主要在非結(jié)球植株葉片的近軸部分表達(dá)，而在結(jié)球植株葉片的任何部分均不表達(dá)。 圖2 LsSAW1基因?qū)ι私Y(jié)球的作用及其表達(dá)模式的功能驗證 LsSAW1調(diào)控葉片近軸與遠(yuǎn)軸的許多基因 對野生型LsSAW1和Lssaw1突變體的幼葉進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了1794個差異表達(dá)基因。許多DEGs與葉背腹面有關(guān)，表明LsSAW1參與了葉背腹面的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于生菜結(jié)球的發(fā)育。進一步通過激光捕獲顯微解剖（LCM）從葉片的近軸與遠(yuǎn)軸分離細(xì)胞，并進行轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果顯示，LsSAW1影響葉片近軸與遠(yuǎn)軸許多基因的表達(dá)模式，并發(fā)現(xiàn)生長素信號與生長控制相關(guān)基因在在Lssaw1植株的DEGs中顯著富集。進一步分析近軸與遠(yuǎn)軸的差異基因發(fā)現(xiàn)，Lssaw1下調(diào)了近軸基因，上調(diào)了遠(yuǎn)軸基因，從而促進了生菜結(jié)球的發(fā)育。 圖3 LsSAW1功能缺失導(dǎo)致近軸基因下調(diào)，遠(yuǎn)軸基因上調(diào) 在Lssaw1突變體中，近軸基因LsAS1下調(diào)和遠(yuǎn)軸基因LsYAB1的抑制作用減弱，有助于葉球的發(fā)育 為了驗證Lssaw1通過調(diào)節(jié)近軸和遠(yuǎn)軸基因而促進葉球發(fā)育的假說，研究者選擇了一個近軸基因LsAS1進行進一步的分析。原位雜交表明，LsAS1主要在不結(jié)球植株葉片近軸部表達(dá)，而在Lssaw1突變體中表達(dá)量顯著降低。通過ChIP-seq、酵母單雜以及EMSA實驗均表明，LsSAW1蛋白與LsAS1的啟動子結(jié)合。結(jié)合雙熒光素酶和RT-qPCR結(jié)果，研究人員推測功能缺失突變Lssaw1導(dǎo)致LsAS1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致生菜葉球的發(fā)育。并通過在Lssaw1植物中過表達(dá)了LsAS1基因驗證這一猜測。此外，研究人員對遠(yuǎn)軸面基因LsYAB1進行類似的實驗發(fā)現(xiàn)，在Lssaw1突變體中LsYAB1的抑制作用減弱，有助于葉球發(fā)育。 圖4 Lssaw1下調(diào)LsAS1的表達(dá)，促進葉球的發(fā)育 圖5 Lssaw1上調(diào)LsYAB1的表達(dá)，促進葉球的發(fā)育 LsSAW1與LsKN1在結(jié)球中起拮抗作用 研究人員通過酵母篩庫來找與LsSAW1一起調(diào)控葉片背腹性的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LsSAW1與之前研究的LsKN1存在互作，進一步研究發(fā)現(xiàn)，它們在葉球發(fā)育中的作用是相互拮抗的。LsSAW1直接結(jié)合LsAS1啟動子并上調(diào)其表達(dá)，同時減弱LsKN1對LsAS1的抑制作用。 圖6 LsSAW1與LsKN1相互作用，削弱其對LsAS1基因的抑制作用 過表達(dá)LsSAW2挽救結(jié)球表型 在擬南芥中，SAW1和SAW2冗余調(diào)節(jié)葉片鋸齒。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，生菜中的LsSAW1和擬南芥中的SAW1位于同一個分支中，另一個命名為LsSAW2。LsSAW1的同源基因LsSAW2在Lssaw1突變植株中過表達(dá)同樣可以導(dǎo)致生菜不結(jié)球，但由于其表達(dá)水平過低，導(dǎo)致其無法發(fā)揮冗余作用。 圖7 LsSAW2表達(dá)量低，過表達(dá)挽救結(jié)球表型
三、結(jié)論
本研究從基因上克隆了控制生菜結(jié)球的第二個基因，該基因編碼了一個與擬南芥中SAWTOOTH 1蛋白同源的蛋白。通過過表達(dá)和CRISPR/Cas9敲除實驗驗證LsSAW1在結(jié)球中的作用。功能缺失Lssaw1導(dǎo)致植株近軸基因的下調(diào)和遠(yuǎn)軸基因的上調(diào)，從而導(dǎo)致葉球的形成。研究還發(fā)現(xiàn)，LsSAW1與LsKN1共同參與葉背腹性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并且協(xié)同調(diào)控生菜葉背腹性與結(jié)球性。為未來結(jié)球蔬菜作物的研究和育種計劃提供了新的理論依據(jù)。 圖8 生菜結(jié)球基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
本研究的轉(zhuǎn)錄組測序由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
參考文獻(xiàn)： An G, Yu C, Yan C, Wang M, Zhang W, Jia Y, Shi C, Larkin RM, Chen J, Lavelle D, Michelmore RW, Kuang H. Loss-of-function of SAWTOOTH 1 affects leaf dorsiventrality genes to promote leafy heads in lettuce. Plant Cell. 2022 Oct 27;34(11):4329-4347. doi: 10.1093/plcell/koac234.
